肝脏禁食与生酮反应：糖皮质激素协调巨噬细胞-实质细胞互作

免疫和代谢紧密相连，免疫状态和结果受代谢的影响。一方面，代谢和营养状态会影响免疫应答，例如感染是营养不良儿童的常见致死原因；另一方面，合理的热量限制或周期性禁食通过代谢调控免疫细胞状态、改善炎症和自身免疫疾病。然而，禁食期间免疫细胞对体内代谢平衡和其他细胞代谢的影响却鲜有报导。

肝脏是人体代谢调控的中心器官，也是免疫调控的重要器官。在禁食过程中，肝脏通过激活糖原分解、糖异生和脂肪酸氧化（FAO）等代谢通路为大脑、肌肉和其他外围器官提供营养和能量。该过程中，肝实质细胞的作用已经被研究的较为清楚，细胞中的环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）、过氧化物酶体增殖激活受体α（PPARα）和糖皮质激素受体（GR）等转录因子会被激活启动下游代谢基因转录、参与代谢重编程。然而，禁食过程中，肝脏内免疫细胞的代谢变化及其对代谢的反向调控却不清楚。

图源：pixabay

巨噬细胞是肝脏中一种重要的天然免疫细胞，参与抗原处理和呈递、清除病菌、清除衰老细胞和调控免疫等过程。有研究发现，在代谢综合征和糖尿病等病理状态下，肝脏巨噬细胞会参与破坏糖代谢稳态。那么，肝脏巨噬细胞在生理禁食状态下对肝脏代谢的影响是怎么样的呢？2022年2月3日，德国亥霍姆兹中心的Stephan Herzig、Søren Fisker Schmidt团队和乌尔姆大学的Jan Tuckerman团队在Cell Metabolism上发表了题为《A macrophage-hepatocyte glucocorticoid receptor axis coordinates fasting ketogenesis》文章，发现禁食状态下肝脏巨噬细胞通过GR-TNF信号促进肝实质细胞中的FAO和生酮反应，最终导致体内酮体水平升高，并且肝脏巨噬细胞的GR信号是该过程所必需的。本文揭示了肝脏中免疫细胞调控实质细胞代谢的新机制，拓展了我们对免疫-代谢调节的认识，或将为靶向生酮反应的治疗提供新靶点。

肝实质细胞和肝脏巨噬细胞内的GR参与禁食诱导的转录调控

为了研究在禁食过程中肝脏实质细胞和巨噬细胞的行为变化，作者使用了特异性细胞类型核标记分析技术（INTACT）构建了在体标记肝实质细胞的小鼠（HEP-INTACT）和标记巨噬细胞的小鼠（MAC-INTACT），从小鼠活动期（ZT12）开始时禁食，在不同时间点收集肝脏做RNA-seq和ATAC-seq。

作者首先评估了肝实质细胞在禁食期间的转录谱变化。在禁食3h内，糖异生、FAO和PPAR信号通路变化显著，FOXO1、FOXO3和GR等禁食响应因子的活性水平变化显著。其中GR活性变化最大，在禁食3h内迅速上调、禁食16h后显著下调，其靶基因Fkbp5的表达水平以及血清糖皮质激素水平也发生了与之一致的变化。这提示GR是肝细胞内的禁食诱导基因的主要调控因子。

接下来，作者探究了禁食期间肝脏巨噬细胞内转录调控。作者通过RNA-seq鉴定了1000多个巨噬细胞内受禁食调控的基因，这些基因大多编码信号分子。这提示在禁食过程中巨噬细胞可能通过分泌细胞因子影响其他细胞。值得注意的是，在禁食过程中巨噬细胞内的细胞周期相关基因逐渐下调，免疫组化显示禁食24h 后Ki67+ CLEC4F+巨噬细胞和CLEC4F+巨噬细胞的丰度显著下降。

这表明，禁食通过抑制细胞增殖降低了肝脏巨噬细胞的丰度。ATAC-seq分析发现，禁食过程中巨噬细胞内几个干扰素调控因子（IRF）的活性抑制。有趣的是，在禁食早期，巨噬细胞内GR活性和肝实质细胞一样迅速上调、在禁食16h后显著下调。这表明肝脏实质细胞的GR和肝脏巨噬细胞内的GR均参与各自细胞中禁食诱导的转录调控。

禁食过程中肝实质细胞和肝脏巨噬细胞之间的相互影响

在禁食过程中肝实质细胞和巨噬细胞之间是否存在相互作用呢？作者首先用NicheNet分析了肝细胞的配体对巨噬细胞受体及其下游靶基因的作用：肝实质细胞中与巨噬细胞作用最强的前5个配体是FN1、HC、PLG、KNG1和VEGFA，它们在巨噬细胞上有多个对应的受体，受体下游靶基因主要调控趋化因子信号、细胞黏附和细胞周期等过程。禁食期间，这5个配体的表达水平均发生了下调，与之对应的，巨噬细胞中细胞周期相关的基因表达也下调。

禁食期间，巨噬细胞又是如何调控肝实质细胞的呢？NicheNet分析显示，巨噬细胞通过分泌多种炎症、趋化因子与肝实质细胞相互作用，其中TNF是调控能力最强的配体，与肝实质细胞表面多个受体结合，主要调控PPAR通路和脂肪酸降解通路。功能实验发现，抑制巨噬细胞中TNF的表达水平能抑制肝实质细胞中RELA基序的结合活性及下游和禁食诱导相关基因的转录水平。这表明，禁食期间，肝实质细胞和巨噬细胞相互应用，实质细胞可以抑制巨噬细胞增殖，巨噬细胞可以调控实质细胞的代谢。 

禁食期间巨噬细胞GR调节肝脏内细胞信号通讯和生酮反应

那么禁食过程中，GR是否参与调控巨噬细胞-肝实质细胞之间的相互作用呢？作者发现，和野生型小鼠相比，禁食后巨噬细胞GR敲除的小鼠（GR MAC）的β-羟基丁酸水平显著降低了，肝细胞中FAO/PPAR相关的通路受损（Hmgcs2、Cyp4a14和Hadhb等关键的生酮、FAO基因表达下调），而血糖、体重/组织重量和肝脏甘油三酯无变化。这表明巨噬细胞GR能促进肝脏生酮反应，抑制巨噬细胞GR会损害肝脏生酮反应。为了进一步证实生酮反应损伤是由肝脏内巨噬细胞引起的，作者构建了肝脏巨噬细胞（Kupffer细胞）GR敲除的小鼠（GR KC）。作者发现GR KC小鼠同样有β-羟基丁酸代谢异常，FAO和生酮反应受损等表型。细胞实验也证实，肝脏巨噬细胞的GR能促进肝细胞中FAO和生酮基因的表达。

那么肝脏巨噬细胞的GR是如何调控肝实质细胞中生酮和FAO反应的？作者经过筛选确定了在禁食过程中肝脏巨噬细胞内上调（TNF等）和下调（CD163等）编码分泌蛋白的基因各5个。作者用Nichenet分析这些分泌蛋白对肝实质细胞中代谢通路活性的影响，发现TNF是分泌蛋白中调控活性最强的，其对肝细胞中的生酮和FAO等基因表达变化的影响最为显著。这提示禁食过程中肝脏巨噬细胞GR可能通过抑制TNF促进肝细胞的生酮和FAO反应。

肝脏巨噬细胞GR促进肝细胞GR/PPARα靶基因的协同表达

那么肝细胞中哪些转录因子受巨噬细胞GR-TNF的调控呢？作者基于ATAC-seq数据进行了模拟敲除分析，发现肝细胞中受巨噬细胞GR调控的下游基因的增强子多是GR和PPARα的靶基因。并且，在特异性敲除肝细胞内GR和PPARα的小鼠中表达水平都下调的基因在GR MAC小鼠中也下调，这提示巨噬细胞GR通过TNF促进了肝细胞GR和PPARα的协同作用。进一步研究发现GR MAC小鼠肝细胞中GR核定位而非PPARα的核定位发生了下调。

TNF选择性抑制肝细胞内依赖GR调控的PPARα靶基因

前述发现表明TNF是介导巨噬细胞-肝细胞相互作用的主要因子，那么TNF是如何影响肝细胞的？作者发现，低剂量的TNF就能抑制GR MAC小鼠肝细胞中的禁食诱导基因的表达，但是TNF抑制的基因能被GR激动剂或PPARα+GR激动剂稳定地上调，而单独PPARα配体的激活效果则非常有限。这提示TNF并非调控所有的PPARα下游靶基因。那么是哪些基因受到了TNF的调控呢？作者发现IL-1β能抑制PPARα所有下游靶基因的表达，而TNF则只抑制GR和PPARα共激活的靶基因Hmgcs2和Cyp4a14。这表明禁食期间巨噬细胞GR通过抑制TNF促进肝细胞GR和PPARα共同靶基因的激活来上调FAO和生酮反应。

肝巨噬细胞中的GR是肝细胞中GR依赖的禁食生酮所必需的

上述发现表明禁食过程中巨噬细胞GR是肝细胞GR激活生酮反应所必需的。以此推测，肝细胞GR敲除小鼠（GR HEP）应该和GR MAC小鼠一样表现为生酮受损，肝细胞和巨噬细胞GR都敲除的小鼠（GR DKO）的生酮不会进一步损伤。作者发现，确实如此，GR HEP小鼠与GR MAC 的空腹血清酮体水平有相似的降低，而GR DKO小鼠酮体水平没有进一步降低。同样，Hmgcs2和Cyp4a14也有类似的趋势。综上所述，禁食期间，肝脏巨噬细胞GR是抑制TNF、促进肝细胞GR核定位、上调GR/PPARα依赖的FAO/生酮反应所必需的。

总结

肝脏是机体代谢和免疫调控的重要脏器，肝脏巨噬细胞是其中重要的天然免疫细胞。然而，肝脏巨噬细胞对肝脏代谢的影响及其作用机制尚不明确。本文中，作者通过INTACT技术解析禁食期间肝脏巨噬细胞对肝脏生酮反应的影响。具体而言，禁食期间，巨噬细胞GR活性上调，并通过抑制TNF的表达来促进肝实质细胞中GR的核定位、上调GR/PPARα共同的下游靶基因的表达水平，进而上调肝细胞的生酮反应和FAO，最终上调肝脏酮体水平。并且肝脏巨噬细胞GR活性是该过程所必需的。

总之，本文发现了生理状态下肝脏免疫细胞对肝脏代谢的影响，拓宽了我们对免疫-代谢相互作用的认识。生酮反应对疾病的进展有重要影响，例如，肝细胞生酮反应和线粒体乙酰乙酸代谢会加速饮食诱导的肝纤维化，肝脏生酮反应对细菌感染期间组织耐受和生存有重要作用。本文的发现或将为靶向生酮反应提供新靶点。

文/阿司匹林 SHGH

责编/Rena

链接：https://doi.org/10.1016/j.cmet.2022.01.004

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