图说 | CRISPR-RNA诱导的适应性免疫反应系统

背景

CRISPR是原核生物基因组内的一段重复序列，细菌和古细菌已经进化出复杂的适应性免疫反应系统，它们依赖于CRISPR（聚集的规则/间隔的短回文重复序列）位点和CRISPR相关（cas）基因的不同盒。CRISPR系统分为三种主要类型（l-l l l）和至少十一种不同的亚型（I-A至l-F、11-A至ll-C和lll-A至lll-B）。尽管存在这种多样性，所有CRISPR-Cas免疫系统都经历三个主要阶段：获得、CRISPR-RNA（crRNA）生物发生和靶向干扰。

原文

主图

Stage 1

外源DNA的获取：

外来核酸被Cas蛋白识别，入侵DNA的短片段（30-50碱基对）被称为原间隔序列，作为间隔序列插入宿主（病毒DNA）的CRISPR位点，通过重复序列分离。在I型和II型系统中，原间隔区是从入侵DNA的区域中挑选出来的，这些区域的两侧有一个叫做PAM（原间隔区相邻序列）的2-5核苷酸（nt）序列。原间隔蛋白通常在CRISPR位点的一端被称为leader，其机制涉及到原间隔蛋白上的Cas1、Cas2和游离3'羟基。原间隔区整合伴随着先导末端重复序列的重复，这可能涉及宿主聚合酶和DNA修复机制。

Stage 2

crRNA的生物合成：

CRISPR-RNA的生物合成首先是转录，然后是原转录物（pre-crRNA）的核溶解处理，将其转化为CRISPR衍生的短RNA（crRNA）文库，每个文库都包含一个与以前遇到的外源DNA互补的序列。crRNA引导序列的两侧是相邻重复序列的区域。

在I型和III型系统中，CRISPR的原始转录本由CRISPR特异性内啡肽清除酶（Cas6）处理，该酶在重复序列内裂解。在许多I型系统中，重复序列是回文序列，Cas6与crRNA 3'端的茎环保持稳定相关。在III型系统中，Cas6与CRISPR RNA瞬时结合，crRNA的3'端被未知的核酸酶进一步修饰。

II型系统中的CRISPR RNA处理依赖于反式作用的crRNA（tracrRNA），其中包含一个与重复序列互补的序列。这些双链区域在Cas9存在下由RNaseⅢ处理。在II型系统中，目标干扰需要tracrRNA和crRNA。来自该系统的两个RNA已经融合成一个单一的引导RNA（sgRNA），Cas9已经成为多种细胞类型和多细胞生物靶向基因组工程的有力工具。

Stage 3

靶向干扰：

成熟的crRNA引导Cas蛋白到达互补靶点。目标序列被专用的Cas核酸酶降解，但目标降解的机制是多种多样的。

I型和II型系统都以含有PAM和互补原间隔序列的dsDNA底物为目标。II型系统中的目标切割是由一个单一蛋白质（Cas9）和两个RNAs完成的，而I型系统依赖于结合dsDNA底物的多亚单位监视复合物，然后招募Cas3，这是一种反式作用核酸酶，通常与一种ATP依赖的螺旋酶融合。

III型系统也依赖于多亚单位复合物进行目标检测，但与I型系统不同，这些复合物表现出内源性核酸酶活性，以转录依赖的方式降解复杂RNA和目标DNA。III型系统不依赖PAM进行目标识别；相反，碱基配对超出了引导序列，延伸到crRNA信号“self”的5'端（CRISPR位点包含与引导和5'端互补的序列），并阻止靶点分裂。

结束循环

在I型系统中，监视复合体的目标结合导致Cas3介导的目标降解（直接干扰）或启动捕获，这涉及到crRNA引导的Cas3、Cas1和Cas2向外源DNA的募集，并导致快速捕获新的间隔序列到CRISPR中。虽然在II型系统中尚未观察到启动采集，但正确选择原间隔区需要Cas9，这表明目标干扰和外来DNA采集之间存在功能联系。最近，产生被称为抗CRISPRs蛋白的各种病毒编码基因被证明通过干扰不同阶段的每一个来破坏CRISPR系统。

应用

CRISPR-Cas9基因编辑技术，是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，这项技术也是用于基因编辑中前沿的方法，以CRISPR-Cas9基础的基因编辑技术在一系列基因治疗的应用领域都展现出极大的应用前景。

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