10分项目文章：不做机制，也能出高分文章 | 微生物专题

合作课题组近期接连发表10分+的微生物组研究文章，仔细看完，其中一些研究并没有涉及复杂的机制讨论和验证实验。他们是怎么做到发10分文章的呢。下面以复旦大学附属肿瘤医院课题组发表在Clinical Cancer Research（IF 10.107）的研究为例，为你全文解读其中的实验设计与数据分析思路，启发思考。

如果你对菌群多样性分析，特别是16S测序数据不熟悉，请一定先查看微生物16S测序数据的正确打开方式 ，这样才能更好理解下文内容。

科研问题

直肠癌患者局部复发风险高，新辅助放化疗（neoadjuvant Chemoradiotherapy，nCRT）已成为局部进展期直肠癌（Locally Advanced Rectal Cancer，LARC）患者的标准治疗方法。然而，nCRT的治疗效果存在个体差异。近20％接受nCRT治疗的患者可能发生与治疗相关的不良反应，如疲劳、放射性直肠炎和骨髓抑制。在这种情况下，找到一种能够准确预测患者对nCRT治疗应答的工具就突显出重要性，然而目前还没有这样的工具。

TIPs：找标志物是临床科研中长盛不衰的研究内容，相较机制研究，也更易上手。从哪个组学找，找谁做标志物，得有讲究。综合研究热度、现有基础、临床转化、样本获取等多个因素，本研究从微生物组入手，选取肠道菌群为潜在标志物的研究对象。

研究目的

已有研究表明，肠道菌群与抗肿瘤免疫治疗和化疗应答有关。然而，关于肠道菌群在预测LARC患者的nCRT疗效方面的循证研究尚不多见。通过设计前瞻性的纵向研究来评估患者肠道菌群预测nCRT应答的可行性。

研究设计

收集84名LARC患者在nCRT治疗前后的粪便和31名健康受试者基线期粪便，使用16S测序对其中的肠道菌群进行检测和分析。根据对nCRT的病理反应将患者分为应答组（Responders）和无应答组（Non-responders）。在鉴定出与nCRT应答相关的微生物标志物后，用37名患者的基线样本（训练队列）构建nCRT应答预测的随机森林分类器，并在另一组47名患者队列中得到了验证（见图1）。

图1 实验设计

LARC患者纳入标准

• 完全知情并愿意为研究提供书面知情同意书；

• 年龄18-70岁，女性或男性；

• ECOG评分0-1；

• 组织学证实为直肠癌，病变位于距肛缘12 cm以内；

• 影像学未发现转移性病变；

• 全面检查后需要进行nCRT；

• 有足够的器官功能来耐受治疗和研究过程。具体检测指标见文章辅助材料。

健康受试者纳入标准

• 完全知情并愿意为研究提供书面知情同意书；

• 年龄18-70岁，女性或男性；

• 综合临床症状、体征、实验室检查和影像学评估为无任何恶性肿瘤；

• 检查结果在正常范围内，包括血液、尿便检查、生化检查等。

注：健康受试者为LARC患者的同居者，以便控制生活方式或饮食中的混杂因素。

LARC患者和健康受试者排除标准

• 5年内有其他恶性肿瘤病史(治愈的宫颈原位癌和皮肤基底细胞癌除外)；

• 有其他代谢性疾病(如2型糖尿病、炎症性肠道疾病等)；

• 有可能干扰微生物组分析的腹部手术史；

• 严重活性感染；

• HIV、梅毒螺旋体、结核杆菌等的感染史；

• 在粪便采样前四周内接触任何类型的抗肿瘤治疗或辐射；

• 在粪便采样前四周内接触任何抗生素、益生菌、益生菌、类固醇、免疫抑制剂。

样本采集与菌群检测

对每名LARC患者，在nCRT治疗开始的第一天（pre-nCRT，n=84）和治疗结束（post-nCRT，n=83）的3天内依次采集两份粪便样本。在基线期对每个健康人采集一份粪便样本(Control，n=31)。所有样本都在-80 °C下保存。菌群分析采用16S测序。

TIPs：相比横断面设计，重复取样的纵向设计更具有统计学效力，也能更好地反映肠道菌群在nCRT治疗前后的变化与应答的关系。关于健康对照组的选取，通常是从参加体检的人群中选取，而本研究选取的是与患者一同生活的同居者，以便控制生活方式或饮食中的混杂因素，值得参考。关于纳入与排除标准目前没有统一的规定，需要既结合临床标准也参考同领域研究中的标准来综合确定。

研究发现

主要分析内容

1. LARC患者的肠道菌群明显不同于健康人

1. 尽管在基线期LARC患者和健康人之间没有观察到显著的alpha多样性差异，但在beta多样性（PCoA）比较时，LARC患者和健康个体明显地区分开来（图2A左上）。

2. 相较于健康人样本的均一性，LARC患者的样本又可以分出两个簇LARC type1和LARC type2（图2A左下），LARC type1与正常人和LARC type2有显著性差异，而LARC type2与健康人之间无显著性差异。

3. 在菌群组成上，所有样本中的优势菌门是Firmicutes , Actinobacteria和Bacteroidetes (图2B)。与健康人相比，LARC患者中有15个菌属显著富集(图2C)，包括Prevotella, Porphyromonas, Fusobacterium, Parvimonas和Peptostreptococcus。

4. 除特定微生物外，应关注微生物群落变化对结直肠癌进展的作用。分析微生物群网络和细菌表型，发现LARC患者和健康人的微生物群网络有显著差异(图2D-E)。健康人的肠道菌群相互作用大多发生在菌属内，与此相反，LARC患者的肠道菌群形成了由不同属组成的两个紧密相连的模块。

5. 一个模块由“有益菌群”组成，以生产丁酸的细菌为中心，包括Faecalibacterium prausnitzii, Roseburia和Eubacterium。丁酸是正常结肠细胞的首选能源，通过调节细胞功能，包括基因表达、炎症、分化和凋亡，来维护肠道健康，并且有报道，丁酸产生菌可以抑制肿瘤生长。

6. 另一个模块由“致病菌群”组成，以Bilophia wadsworthia和Bacteroides ovatus为中心，据报道它俩都与结直肠癌有关。具体地说，B.wadsworthia是一种亚硫酸盐还原菌，在富含饱和脂肪的饮食中会相应升高，并刺激辅助型T细胞（Th1）免疫反应，导致结肠炎。

7. 细菌表型预测分析发现，与健康人相比，LARC患者的潜在致病菌增加。

图2 LARC患者（n=84）的肠道菌群与健康人（n=31）有显著差异

TIPs：阐释菌群16S测序结果通常从alpha多样性和beta多样性开始。进一步鉴定出丰度显著差异菌（关键菌），这些菌既可以作为潜在候选疾病标志物也可以作为后续揭示菌群与疾病发生发展关系的目标菌。本研究结合菌群网络分析和表型分析，在LARC患者的肠道菌群中发现并定义了2个与CRC相关的菌群模块——“有益菌群”和“致病菌群”，较有新意，值得学习。

2. nCRT治疗过程中肠道菌群变化与疗效的关系

1. 下一步探索nCRT将对肠道菌群产生什么影响，以及这些对菌群的干扰是否会与治疗应答相关。在nCRT治疗前后采集患者粪便样本，分析菌群的时序变化。

2. 与post-nCRT（nCRT治疗后）样本相比，pre-nCRT（nCRT治疗前）样本显示出明显更高的多样性和更高不均匀性的趋势(图3A)。有趣的是，应答（R）亚组的菌群变化比无应答（NR）亚组更显著，丰富度和Chao1指数的下降在R亚组中均达到统计学意义，但在NR亚组中无统计学意义。

3. PCoA分析显示患者菌群按照采样时间点表现出明显的聚类效应（图3B）

4. LEfSe分析菌群差异结果显示，在nCRT后，Fusobacterium、Peptostreptococcus、Parvimonas和Porphyromonas显著下降，Lactobacillales中的两个菌属，Lactobacillus和Streptococcus显著增加。特别是，Streptococcus只在R亚组中发现增加（图3C-D）。这表明，共生菌Lactobacillales的增加可能与nCRT应答有关。

5. Streptococcus的重要性也体现在微生物群网络中(图3E-F)。在post-nCRT样本中，不管治疗应答如何，“致病菌群”都与周围的Streptococcus相互作用。具体地，在R组的post-nCRT样本中，“致病菌群”和“有益菌群”是通过Streptococcus连接，这在NR组的post-nCRT样本中没有观察到。此外，大多数菌属间的相互作用是正向或共生的；然而，除了健康个体外，R组的post-nCRT样本中也观察到了菌属负向或拮抗的相互作用。

6. 具体地说，与丁酸产生相关的两个细菌，即Roseburia和Dorea，会与NR组富含的Ralstonia竞争。另一种产丁酸的细菌Anaerostipes（R组富含）与Streptococcus一起，会与结直肠癌相关的Bilophila竞争。

7. nCRT降低了LARC相关细菌的丰度，Bugbase显示nCRT后LARC患者的潜在致病菌显著减少。nCRT显著降低了LARC患者的肠道菌群丰富度，其程度可能与nCRT的应答有关。此外，nCRT通过减少肠道病原菌和增加有益共生菌来重塑肠道菌群，而后者仅在R亚组观察到。

图3 nCRT治疗过程中肠道菌群的变化与治疗应答相关

TIPs：本节内容将比较对象更换为post-nCRT vs pre-nCRT，其中的数据讨论模式与第一节是相同的。本节中的数据分析紧扣nCRT治疗对菌群的影响。

3. LARC患者基线期肠道菌群与nCRT疗效相关

1. 根据上述结果，有足够理由推测肠道菌群可能为预测LARC患者对nCRT的疗效提供潜在的生物标志物。为验证这一假设，对基线期R组和NR组进行横断面比较分析。

2. 与LARC vs 健康人一样，R组与NR组的alpha多样性没有显著差异。PCoA分析显示，根据nCRT响应状态，在pre-nCRT和post-nCRT样本中都显示出显著的聚类效应（图4A-B）。 

3. 在控制了潜在的混杂因素后，MiRAKT分析结果表明，微生物组特征和nCRT治疗应答之间的相关性在统计学上是显著的。

4. 与LARC type1相比，与健康个体菌群相似的LARC type2对nCRT的应答率明显更高（图4C）。

5. 考虑到复杂的治疗因素可能会对nCRT应答的预测结果产生偏差，寻找作为标志物的差异菌群，重点放在了基线期样本上。

6. LEfSe分析显示，在R组中，Clostridium XVIII属和R. inulinivorans, Dorea formicigenerans 和Anaerostipes hadrus种显著富集；在NR组中，Coriobacteriaceae科、Fusobacterium和 Granulicatella属，以及R. pickettii和E. tayi种显著富集（图4D）。

7. 对nCRT应答的差异也反映在pre-nCRT样本的微生物群网络中(图4E-F)。“有益菌群”在R组中的聚集度比NR组高，而“致病菌群”在NR组中的聚集度比R组高。值得注意的是，只在NR组观察到“有益菌群”与两种CRC相关细菌Bacteroides和Alistipes发生相互作用。在“致病菌群”环境中，R组中观察到有益菌，包括Akkermansia、Bifidobacterium和各种丁酸产生菌与致病菌的相互作用，而在NR组中观察到NR相关的Coriobacteriaceae中的Collinsella属与致病菌的相互作用。

8. 结合前述结果，推测Roseburia, Dorea和Anaerostipes与nCRT应答有关，而Coriobacteriaceae，Fusobacterium，Granulicatella，R. pickettii和E. tayi可能与nCRT抗性有关。

图4 LARC患者基线期肠道菌群与nCRT疗效的相关性

TIPs：本节数据讨论模式仍然与前几节相同，紧扣R组和NR组菌群差异与nCRT应答的关系。

4. 基于肠道菌群特征建立nCRT应答预测分类器

1. 为将上述发现转化为临床应用，利用随机森林算法构建LARC患者的应答-预测分类器。

2. 将84名患者的pre-nCRT样本随机分为两个队列：训练队列（Training cohort）由19名应答者和18名无应答者组成，用他们的菌群数据构建分类器；验证队列（Validation cohort）由剩下的26名应答者和21名无应答者组成。在构建只包含微生物变量的分类器I时，选择了40个潜在的差异菌属来作为输入特征集。经过5次10倍交叉验证，选出10个微生物变量作为构建分类器的最佳集合。AUC值在训练队列中为93.57%，在验证队列中为73.53% (图5)。

3. 在选出的10个菌属变量中，Dorea、Anaerostipes和Clostridium XVIII是nCRT应答者的生物标志物，Eisenbergiella、Granulicatella和Ralstonia是nCRT无应答者的生物标志物；Ruminococcus2和Phascolactobacterium在LARC患者中显著富集，Akkermansia在健康人中显著富集，Streptococcus在nCRT治疗后显著升高。

   图5 建立基于肠道菌群的nCRT应答预测分类器I

4. 此外还构建了分类器II，除了微生物变量，引入26个临床变量，包括患者年龄、性别、BMI以及与肿瘤生物学和治疗细节有关的参数。同样经过5次10倍交叉验证，从66个变量中选出11个变量，仅有卡培他滨（capecitabine）一个临床变量入选。两个分类器的性能没有显著差异（图6）。

图6 建立基于肠道菌群和临床变量的nCRT应答预测分类器II

TIPs：有了前三节内容的铺垫，菌群可以作为预测nCRT应答效果的标志物已经顺理成章。采用主流的随机森林算法和ROC曲线分析，来鉴定和评价预测nCRT应答的菌群标志物及其性能。

研究局限

1. 预测分类器的性能和可靠性未采用多中心验证；

2. 构建预测分类器时只使用了属水平的菌群数据。如采用宏基因组测序，将能获取更稳定的种水平的菌群数据，并能获得细菌的基因功能信息。

TIPs：除上述2点局限外，如能加入代谢组检测，将能更好地分析菌群变化引起的代谢物变化，进而对nCRT应答产生的不同影响。肠道菌群+代谢组研究的范例请查看5500字带新手吃透一篇5分肠道菌群文章的内核。

不做复杂的机制验证实验，也能出高分文章，以下微生物研究案例也值得学习和琢磨。

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参考文献

Yi Y, Shen L, Shi W, et al. Gut Microbiome Components Predict Response to Neoadjuvant Chemoradiotherapy in Patients with Locally Advanced Rectal Cancer: A Prospective, Longitudinal Study. Clin Cancer Res. 2020 Dec 9. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-20-3445. Epub ahead of print. PMID: 33298472.

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