Sci Adv：李华兵等发现m⁶A调控肿瘤免疫中的巨噬细胞激活 | m6A专题

RNA结合蛋白（RNA binding proteins, RBPs）是基因表达的关键效应因子，其能够识别数百上千个转录本，形成广泛的调节网络，调控RNA代谢的多个方面，包括转录、剪接、修饰、细胞内运输、翻译和降解等，从而维持细胞稳态和应激反应【1】。

2021年4月28日，来自上海交通大学医学院上海市免疫学研究所李华兵研究员等团队在Science Advances杂志在线发表了题为 Pooled CRISPR Screening Identifies m⁶A as a Positive Regulator of Macrophage Activation 的研究论文，该研究利用CRISPR-Cas9基因筛查系统对巨噬细胞中800多个RBPs进行了筛查，最终发现并揭示了m⁶A甲基化酶METTL3通过加速TLR信号通路抑制分子IRAKM的mRNA降解，促进巨噬细胞活化的新机制。

为了研究RNA代谢对巨噬细胞活化过程的调控作用，研究者首先利用CRISPR-Cas9技术，对参与调控巨噬细胞活化过程的关键RNA结合蛋白进行高通量筛选，发现m⁶A甲基化酶复合物中的关键基因（METTL3、METTL14、NUDT21和RBM15）显著富集在TNFa-Low的细胞群中，提示m⁶A是对巨噬细胞活化十分重要。RNA m⁶A修饰是分布最广泛，丰度最高的RNA化学修饰，其参与RNA代谢调控的各个方面，在免疫系统中的研究主要发现其影响包括造血干细胞分化发育（Immunity | 高义萌/李华兵等合作揭示m6A在天然免疫和造血发育中的重要作用）【2】、T细胞稳态（Nature：中美合作首次发现m6A修饰调控T细胞稳态【附专家点评】丨BioArt特别推荐）【3】、Treg免疫抑制功能（李华兵组揭示m6A调控Treg细胞的抑制功能）【4】、抗病毒免疫和DC成熟等过程。然而m⁶A修饰是否参与调控固有免疫细胞活化过程仍然还不清楚。

接下来，研究者发现在单核/巨噬细胞细胞系Raw264.7及原代巨噬细胞中敲除METTL3均可显著抑制LPS诱导的巨噬细胞活化及后续炎症因子的产生。鉴于巨噬细胞在抗感染和抗肿瘤中的重要作用，研究者对METTL3在体内巨噬细胞中的功能进行了进一步的研究，发现巨噬细胞特异性敲除METTL3的小鼠对沙门氏菌更加易感，抗肿瘤能力下降；敲除METTL3的肿瘤浸润巨噬细胞高表达M2型巨噬细胞相关marker，而M1型巨噬细胞相关marker显著下调，相应的肿瘤浸润T淋巴细胞高表达免疫抑制性受体PD-1。上述结果表明METTL3可通过调控巨噬细胞的活化促进其抗感染和抗肿瘤功能。

进一步的研究发现，敲除METTL3可导致TLR信号通路的负调控应激因子IRAKM显著上调，而对其他关键的接头蛋白的表达水平没有显著影响，而在METTL3缺陷的巨噬细胞中敲低IRAKM可恢复巨噬细胞炎症因子的表达。研究者利用MeRIP-seq发现，Irakm mRNA的3UTR上有显著的m⁶A峰，敲除METTL3后该m⁶A峰消失，证明Irakm是m⁶A的靶基因。RNA降解实验和荧光素酶报告基因实验表明，m⁶A主要通过影响Irakm mRNA的降解，调控TLR信号诱导的巨噬细胞活化。综上，此项研究发现了m⁶A甲基化酶METTL3靶向并降解早期应激反应分子Irakm的mRNA，调控巨噬细胞活化进而影响其抗感染和肿瘤杀伤能力。

该研究是李华兵研究员团队继首次发现m⁶A在T细胞稳态、Treg免疫抑制功能和HSC发育的重要生物学功能之后，再次发现m⁶A在免疫系统中的重要生物学功能。据悉，上海交通大学基础医学院、上海免疫学研究所博士后童吉宇（现四川大学华西第二医院研究员）、王雪飞、刘永波及中国科技大学任星星为本论文的共同第一作者，上海免疫学研究所李华兵研究员、中国科技大学朱书教授、耶鲁大学医学院Richard Flavell教授、上海仁济医院夏强主任为该文的共同通讯作者。

值得一提的是，近日，中国科学院生物物理所杨鹏远、第四军医大杨安钢和芝加哥大学Yan Chun Li等课题组也相继发现了m⁶A甲基化修饰参与调控巨噬细胞的功能，相关研究也于近日发表【5-7】。例如，杨鹏远课题组发现巨噬细胞中m⁶A甲基化酶METTL3能够靶向VSV病毒的double-stranded RNA（dsRNA），进而影响巨噬细胞的抗病毒先天性免疫反应【5】，这些研究均发现了m6A类似的功能，但分子机制各有侧重。

此外，李华兵课题组与上海市免疫学研究所叶幼琼课题组合作，利用生物信息学方法系统揭示了四种主要的RNA修饰（m⁶A、m1A、选择性多聚腺苷酸化和A-I RNA编辑）在结直肠癌中的特定RNA修饰模式，及其在结直肠癌等临床癌症治疗中的潜在指导意义，证明了不同的RNA修饰模式与肿瘤免疫微环境中免疫细胞浸润、共识分子亚型、临床特征、转录及转录后调控、药物反应和免疫治疗效果的相关性。研究者发现RNA修饰模式评分 (WM_Score)高的患者总生存期较短，伴随着M2巨噬细胞和其他抑制免疫细胞浸润、EMT激活和转移，以及与药物敏感性的药物靶向肿瘤发生相关的通路高度相关等生物学特性；低WM_Score患者具有更好的生存优势，与凋亡和细胞周期信号通路激活有关，与靶向凋亡和细胞周期药物敏感性密切相关。进一步的表明WM_Score与PD-L1免疫治疗也具有相关性。本研究首次在结直肠癌中系统性分析了四种RNA修饰并强调了四类RNA修饰酶在癌症治疗中的互相作用，相关研究结果近期已发表在Molecular Cancer杂志【8】。

原文链接：

https://advances.sciencemag.org/content/7/18/eabd4742

参考文献

1. Gebauer F, Schwarzl T, Valcarcel J, Hentze MW. RNA-binding proteins in human genetic disease, Nat Rev Genet 2021;22:185-198.

2. Gao Y, Vasic R, Song Y, Teng R, Liu C, Gbyli R, Biancon G, Nelakanti R, Lobben K, Kudo E, Liu W, Ardasheva A, Fu X, Wang X, Joshi P, Lee V, Dura B, Viero G, Iwasaki A, Fan R, Xiao A, Flavell RA, Li HB, Tebaldi T, Halene S. m(6)A Modification Prevents Formation of Endogenous Double-Stranded RNAs and Deleterious Innate Immune Responses during Hematopoietic Development, Immunity 2020;52:1007-1021 e1008.

3. Li HB, Tong J, Zhu S, Batista PJ, Duffy EE, Zhao J, Bailis W, Cao G, Kroehling L, Chen Y, Wang G, Broughton JP, Chen YG, Kluger Y, Simon MD, Chang HY, Yin Z, Flavell RA. m(6)A mRNA methylation controls T cell homeostasis by targeting the IL-7/STAT5/SOCS pathways, Nature 2017;548:338-342.

4. Tong J, Cao G, Zhang T, Sefik E, Amezcua Vesely MC, Broughton JP, Zhu S, Li H, Li B, Chen L, Chang HY, Su B, Flavell RA, Li HB. m(6)A mRNA methylation sustains Treg suppressive functions, Cell Res 2018;28:253-256.

5. Qiu W, Zhang Q, Zhang R, Lu Y, Wang X, Tian H, Yang Y, Gu Z, Gao Y, Yang X, Cui G, Sun B, Peng Y, Deng H, Peng H, Yang A, Yang YG, Yang P. N(6)-methyladenosine RNA modification suppresses antiviral innate sensing pathways via reshaping double-stranded RNA, Nat Commun 2021;12:1582.

6. Yin H, Zhang X, Yang P, Zhang X, Peng Y, Li D, Yu Y, Wu Y, Wang Y, Zhang J, Ding X, Wang X, Yang A, Zhang R. RNA m6A methylation orchestrates cancer growth and metastasis via macrophage reprogramming, Nat Commun 2021;12:1394.

7. Du J, Liao W, Liu W, Deb DK, He L, Hsu PJ, Nguyen T, Zhang L, Bissonnette M, He C, Li YC. N(6)-Adenosine Methylation of Socs1 mRNA Is Required to Sustain the Negative Feedback Control of Macrophage Activation, Dev Cell 2020;55:737-753 e737.

8. Chen H, Yao J, Bao R, Dong Y, Zhang T, Du Y, Wang G, Ni D, Xun Z, Niu X, Ye Y, Li HB. Cross-talk of four types of RNA modification writers defines tumor microenvironment and pharmacogenomic landscape in colorectal cancer, Mol Cancer 2021;20:29.

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