神秘嘉宾亲译！空间转录组样本准备指南官方说明书-Part 6（FFPE样本切片处理） | 空间转录组专题

空间转录组FFPE切片处理

我们根据10x Genomics官方操作指南CG000407与CG000409,整理了如下FFPE切片脱蜡、染色、解交联及明场成像的实验操作流程。

1. 脱蜡与H&E染色

1.1 试剂准备

（1）脱蜡

（2）H&E染色

准备4个1L烧杯并标记水1,2,3,4， 每个烧杯中加入800ml Milli-Q 水。

（3）封片

85%甘油用无酶水配制并充分翻转混匀。每个盖玻片需准备150-200μL。使用前快速离心，避免产生气泡。

1.2脱蜡

（1）60℃下将玻片在烘箱或装有适配器的PCR仪上放置2h。

（2）在二甲苯I和二甲苯II中分别依次浸泡10分钟。

（3）打开PCR仪，放入芯片和PCR仪适配器，设置37℃预热，无需盖盖子。

（4）在100%乙醇I, 100%乙醇IIIII分别依次浸泡3分钟。

（5）用吸水纸在玻片底部吸去多余液体，注意不要让吸水纸接触切片。

（6）将玻片放在PCR仪上37℃烘干15分钟。

（7）在100%乙醇III, 96%乙醇I, 96%乙醇II, 70%乙醇，Milli-Q水中依次浸泡3分钟。

以上浸泡过程需保证切片充分浸泡在液体中，同时保证液面不要没过玻片标记。

1.3 H&E染色

（1）将玻片放置在干净整的平面上（不要垫纸或布等以免吸收染料）。芯片上允许少量液体残留。

（2） 在玻片上滴加1ml苏木精染料，使之均匀地覆盖玻片上的每个切片。室温下放置3min。

（3）将多余的染料小心倾倒进50ml离心管。

（4）将玻片依次在Milli-Q水烧杯1中浸泡20s。

（5）将玻片依次在Milli-Q水烧杯2中浸泡10s。

（6）用吸水纸在玻片背面吸去多余液体，不要接触组织切片。

（7）将玻片放置在干净整的平面上（不要垫纸或布等以免吸收染料），玻片少量液体残留是允许的。

（8） 在玻片上滴加1ml Bluing Buffer，使之均匀地覆盖玻片上的每个切片。室温下放置1min。

（9）将多余的Bluing Buffe小心倾倒进50ml离心管。

（10）将玻片在烧杯3中轻柔重复“浸入-取出”过程5次，然后浸泡20s。

（11）用吸水纸在玻片背面吸去多余液体，不要接触组织切片。

（12）将玻片放置在干净整的平面上（不要垫纸或布等以免吸收染料），玻片少量液体残留是允许的。

（13）加入1ml伊红酒精溶液 （注意区别于冰冻切片所用的伊红溶液），使之均匀地覆盖玻片上的每个切片，室温下放置1min。

（14）将玻片在烧杯3中轻柔重复“浸入-取出”过程5次，然后浸泡20s。

（15）用吸水纸在玻片背面吸去多余液体，不要接触组织切片。注意不要风干玻片。

1.4 封片

（1）将玻片放置在干净整的平面上（不要垫纸或布等以免吸收染料）。

（2）使用宽口枪头，在每个切片上滴加150-200μL 85%甘油，使之均匀地覆盖每个切片。

（3）使盖玻片末端与玻片接触呈一定角度，轻缓地放下玻片，注意不要引入气泡，使甘油溶液缓慢散开并定型。若甘油过量，小心用吸水纸在盖玻片边缘吸去，注意不要移动盖玻片。

（4）封片结束后，直接进行明场扫片，观察切片中的组织形态。

1.5 去盖玻片

（1）在1L烧杯中加入800ml Milli-Q水。

（2）将芯片依长端方向浸入烧杯直至完全浸没，用手拿住玻片，直至盖玻片缓慢完全脱落。为了保证切片完整，不要上下移动或剧烈摇晃玻片，也不要用手直接剥去盖玻片。

（3）将玻片在1L烧杯中轻柔重复“浸入-取出”过程15次以洗去多余的甘油。

（4）用吸水纸在玻片背面吸去多余液体，不要接触组织切片。

（5）在PCR仪上37℃烘干玻片3分钟，保持PCR仪的盖子处于打开的状态。

（6）如不立即进行解交联实验，可将玻片置于玻片盒中4℃保存（至多保存2周）。

2 解交联

2.1 试剂准备

2.2 实验步骤

（1）将适配器放在PCR仪上，按如下参数设置PCR仪

（2）将玻片放入Visium 芯片盒中；

（3）沿芯片盒孔的边缘用移液枪加入100μL 0.1N HCl均匀地覆盖切片，避免引入气泡。全部加入完成后，轻轻拍打芯片盒边缘，使HCl溶液在样本上均匀分布。在室温下放置1min。

（4）用移液枪将孔中的所有盐酸依次吸出。

（5）继续重复步骤（3）（4）两次，用0.1N HCl共计清洗三次。

（6）沿芯片盒孔的边缘用移液枪加入150μL pH9.0 TE Buffer。

（7）用移液枪吸从芯片盒孔中吸出TE Buffer。

（8）用Visium专用slide封口膜封住芯片盒孔，放入Visium PCR玻片适配器中。

（9）盖上PCR盖子，按上述PCR参数设置，直接开始解交联（Decrosslinking）步骤。

（10）解交联完成后，将芯片盒从玻片PCR适配器中取出，放置在干净平整的工作台面上。

（11）直接进入后续建库步骤。

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