知道这些，微生物DNA提取易如反掌 |不收藏就亏了系列
微生物是一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称。它们是一些个体微小、结构简单的低等生物。
它的特征可以归纳为三十个字：即体积小、面积大、吸收多、转化快、生长旺、繁殖快、适应强、变异频、分布广、种类多。
微生物大多为单细胞，少数为多细胞，还包括一些没有细胞结构的生物。主要有古菌；属于原核生物类的细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、立克次氏体；属于真核生物类的真菌、原生动物和显微藻类。
微生物之间以及微生物与其所处环境间的相互作用极为复杂，通过宏基因组学结合宏转录组学以及新一代质谱技术催生下的宏蛋白质组学和宏代谢组学, 人们可以更全面、系统地解析微生物组的结构和功能。
这将为解决人类面临的能源、生态环境、工农业生产和人体健康等重大问题带来新思路。
在微生物基因组研究中，目前最为火热也最为成熟的就是基于高通量测序的扩增子测序以及宏基因组学的研究。而微生物DNA的提取则是研究的前提。
本文主要介绍微生物DNA提取的一些相关原理，让你不用试剂盒也能提取出高质量的DNA。
一、样本类型及前处理
①土壤：
常见的土壤类型主要有壤土、沙土和污泥（淤泥）。壤土有机质含量多，含有的微生物最多，污泥次之，沙土最少。
但壤土杂质含量也比较多，尤其是腐殖酸等有机物，如果不进行脱腐处理，产物里则会含有大量的腐殖酸，而腐殖酸也会抑制PCR扩增中的Taq酶以及酶切反应的限制性内切酶活性，影响后续实验。因此土壤微生物提取前需要进行脱腐处理。
国际腐殖质协会通用的腐殖酸提取方法为“碱溶酸析”，先用碱性溶液将腐殖酸变为腐殖酸盐，然后再用酸进行析出，具体反应公式为：
在提取土壤DNA时，先在样品中加入碱溶液，振荡混匀后高速离心，弃上清，可以去除大部分的腐殖酸。随后加入裂解液进行裂解，再加入醋酸溶液（PH4~5），进行酸析，将剩余的腐殖酸析出，然后高速离心，取上清进行后续纯化实验，可以得到纯度较高的DNA产物。
对于沙土而言，有机质含量比较少，可以不进行脱腐处理。由于沙土微生物含量比较少，提取之前需要进行富集。
可以将沙土样品放入50mL离心管中，加入生理盐水进行振荡混匀，然后静置数分钟，取上清进行高速离心，收集菌体。
由于沙土中的砂粒沉降速度比菌体快，绝大部分菌体还是存在于上清溶液中的。
壤土（左）和沙土（右）的沉降速度比较
②滤膜（纸）
滤膜（纸）的前处理需要根据其所过滤的溶液决定。如果过滤的是土或者淤泥，则前处理与土壤处理类似。如果是过滤的其他液体，比如水体、乳汁等液体，可直接进行后续实验。此外，滤膜（纸）在添加裂解液之前，尽量用无菌剪刀剪成碎片，便于研磨和裂解。
③水体
如果水体含菌量较多，可以直接加裂解液进行裂解。如果菌体较少，可以高速离心进行富集。
④发酵液
发酵液一般杂质含量较多，可用无菌纱布先进行过滤，取滤液进行后续实验。
⑤青贮
青贮的微生物含量较为分散，可以先将其放置于15mL 或者50mL离心管中，加入生理盐水，振荡混匀，再将含有微生物的生理盐水倒出，高速离心进行菌体富集。
⑥其他样本类型
其他样本类型，比如粪便、拭子、唾液、菌液、植物和动物组织，可以直接进行裂解。其中植物和动物组织，在裂解前需要将其用剪刀分成小块，便于研磨和裂解。
二、研磨与裂解
1、裂解液的选择与使用
实验室常用的也是最有效的裂解液是以CTAB和SDS为主要成分的裂解液，不同样本类型，需要选择不同的裂解液。在选择之前，需要知道这两种主要成分的相关性质。
CTAB：中文全称为十六烷基三甲基溴化铵，是一种季铵盐。化学稳定性好，耐热、耐光、耐压、耐强酸强碱。易溶于乙醇、异丙醇、氯仿，溶于10份水，微溶于丙酮，几乎不溶于乙醚和苯。属于阳离子表面活性剂（其分子中的氮原子含有孤对电子，故能以氢键与酸分子中的氢结合，使氨基带上正电荷），可溶解细胞膜。
在高离子强度的溶液里，CTAB与蛋白质和大多数多聚糖形成复合物，但不沉淀核酸。因此，CTAB可以用于从含糖量较高的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌中提取DNA 。
CTAB分子结构式
SDS：中文全称为十二烷基硫酸钠，易溶于水，微溶于乙醇，几乎不溶于氯仿、乙醚。属于阴离子表面活性剂（在水中电离后起表面活性作用的部分带负电荷）。在高温条件下（55-65℃），裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸。
SDS分子结构式
由CTAB和SDS的性质可知，在面对不同的样本类型时，需要选择不同的裂解液。
由于CTAB与蛋白质和大多数多聚糖形成复合物，而细菌细胞壁的主要成分为肽聚糖（尤其是革兰氏阳性菌），所以，对革兰氏阳性菌的基因组进行提取时，CTAB的裂解效果会优于SDS。而对于蛋白质含量较多的菌体，以及含有染色质的真菌，SDS的提取效果会优于CTAB。
虽然CTAB和SDS可以对细胞进行裂解，但是，如果去除不干净，会影响后续PCR实验，尤其是SDS，0.01%即可完全抑制PCR，0.005%可显著降低产量。
因此，在实验中需要结合CTAB和SDS的性质，在其完成裂解后进行去除。CTAB易溶于氯仿，因此，在使用CTAB进行裂解时，完成后用氯仿进行抽提，CTAB会溶于氯仿中。
高速离心后，氯仿密度大，在最下层，而核酸不溶于氯仿在上层水相，变性蛋白质在中间层。只需要将含有核酸的水相进行纯化即可得到基因组DNA。
SDS几乎不溶于氯仿，用氯仿抽提后，SDS会存在于上层水相，导致去除不彻底。但SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。在1mL 1%的SDS溶液中，加入100uL 3M NaCl，会产生沉淀（SDS析出）。
如果把NaCl换成KCl，沉淀的量会更多，这是因为SDS遇到钾离子变成了PDS（十二烷基硫酸钾），而PDS是不溶于水的，因此产生沉淀。
由于SDS会和蛋白质结合，SDS变成PDS的同时，会把结合的蛋白质一起给沉淀下来。经过高速离心，核酸会存在于上清溶液中。
SDS裂解后加入KCl产生的沉淀
2、酶的选择与使用
微生物DNA提取中常用的酶是蛋白酶K和溶菌酶，有时还会用到几丁质酶。在使用每种酶之前，需要对其性质有所了解。
但是需要注意一点，需要低温储藏的酶反复冻融，其活性会大大降低，使用前先进行分装。
· 蛋白酶K是一种从白色念珠菌分离出来的强力蛋白溶解酶，是DNA提取的关键试剂。该酶在较广的pH（4~12）范围内及高温(50~70°C)下均有活性。
在DNA提取中，主要作用是酶解与核酸结合的组蛋白，使DNA游离在溶液中，随后除去杂质，收集DNA。与此同时，EDTA等螯合剂或SDS和CTAB等去污剂均不能使之失活。
· 溶菌酶又称胞壁质酶，是一种能水解细菌中黏多糖的碱性酶。溶菌酶主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物溢出。
溶菌酶具有很强的热稳定性，在60-70℃条件下仍有活性。溶菌酶在酸性介质中可稳定存在，在碱性介质中易失活，最适PH为6.5。值得注意的是，SDS会抑制溶菌酶的活性，溶菌酶加入到含有SDS的裂解液中，会产生絮状沉淀，失去活性。
· 几丁质酶是以几丁质为作用底物的水解酶，几丁质又称甲壳素或者甲壳质，存在于节肢动物的体壁，以及真菌的细胞壁。
所以，几丁质酶可以溶解真菌的细胞壁。几丁质酶PH耐受范围较宽，在微酸和微碱中均能起作用。在30-60℃之间活性较高，温度超过60℃活性会迅速降低。
对于细菌而言，在提取中只需要加入溶菌酶，对于真菌，除了溶菌酶，还需要加入一定量的几丁质酶。
在选择不同的酶之前，需要知道反应体系的酸碱性，以及裂解温度是否影响酶的活性。如果和裂解体系有冲突，可以选择先加酶再加裂解液。比如，SDS抑制溶菌酶的活性，可以选择先用溶菌酶去消化，然后再加入SDS，使菌体裂解更完全。
3、研磨材料的选择与使用
微生物提取中，需要用到的研磨材料主要有钢珠、研磨珠和玻璃砂。研磨材料配合研磨仪使用，效果会更好。
对于土壤样本，可以选择研磨珠进行研磨；水体、菌液、发酵液及富集后的青贮样本，可以选择玻璃砂进行研磨；植物组织，需要用钢珠进行研磨；动物组织需要用钢珠加玻璃砂进行研磨。
此外，研磨时间不可过长，钢珠研磨一般不要超过5min，玻璃砂研磨不要超过3min，研磨珠研磨不要超过15min，时间过长，提取的DNA片段长度较小。
三、产物纯化
目前的纯化方法主要有氯仿抽提法、醇沉淀法、离心柱法和磁珠法。每种方法各有优劣。
· 氯仿抽提需要用到氯仿这一有机试剂，纯化后的核酸纯度较高，而氯仿属于危险化学品，实验具有一定的危险性。氯仿抽提法成本低廉，对实验条件要求低，对于经费紧张的实验室较为适用。
· 醇沉淀法常用到的醇为乙醇和异丙醇。异丙醇比较疏水，能更好的沉淀核酸，0.6倍体积的异丙醇就可以达到较好的沉淀效果。
乙醇比异丙醇亲水，能去掉一些盐离子，实验室常用80%的乙醇洗涤样品。用异丙醇沉淀后，一般会用乙醇再次沉淀，因为乙醇更易挥发，对下游实验影响小。
· 离心柱法是试剂盒普遍采取的方法，最大特点就是产物纯度高，但提取效率比较低，同时成本也比较高。
· 磁珠法所用到的生物磁珠，表面具有丰富的活性基团，可以与核酸进行偶联，由于具有超强的顺磁性，在外磁场的作用下，可以将核酸与样品进行分离。磁珠法可以进行大规模的核酸纯化。
虽然产物纯化方法主要分为这几类，但实际应用中，不同的方法相结合使用，才能得到纯度和质量都较高的DNA产物。
四、总结
微生物DNA的提取流程和动植物DNA提取流程大致相同，只不过微生物提取的样本类型比较复杂，需要对样本进行前处理，提取流程也会复杂一点。
但是，流程不是一成不变的，只要明白了各个流程的实验原理，然后根据实验目的，选择适合的实验流程与方法，肯定会得到想要的微生物DNA。
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