肿瘤微生物＋多组学轻松登上33分的JAMA Oncology

论文标题：Association of Intratumoral Microbiota With Prognosis in Patients With Nasophary ngeal Carcinoma From 2 Hospitals in China

刊登日期：2022年07月

发表杂志：JAMA Oncology

影响因子：33.006

技术手段：16S rDNA测序、宏基因组测序、转录组测序

（一）研究背景

微生物群与肿瘤的相互作用使微生物群成为各种类型癌症中有重要作用的预后生物标志物。肿瘤内相对较低的微生物量使得细菌负荷成为肿瘤发生发展的关键因素。尽管鼻咽是上呼吸道微生物群的重要生态位，但鼻咽癌（NPC）中是否存在鼻咽癌微生物群及其临床意义仍不确定。本研究通过大规模队列（临床鼻咽癌患者）评估瘤内细菌对鼻咽癌患者个体预后的临床意义。【万字综述】Protein & Cell：微生物，肿瘤微环境中的不速之客

（二）研究方法

01研究群体

作者从非转移NPC患者中收集了802份活检组织，研究群体样本来源及入组分组见图1；所有的患者进行放射性治疗，其中694例（86.5%）接受化疗，在治疗期间没有患者出现肿瘤恶化的情况。48例NPC配对患者样本用于肿瘤微生物群组成（16S rDNA测序和FISH实验）及肿瘤内细菌来源追踪。另外，作者同时收集其中20名NPC患者的活检组织、鼻咽拭子、唾液和粪便样本（宏基因组测序SNV分析），这些患者在采样前2周内未接受抗菌治疗。

图1 样本来源及入组分组条件

02实验方法

作者首先对48对NPC配对患者的组织样本进行16S rDNA测序（两组患者的性别、年龄、TNM分期及治疗方案等临床信息相对均衡）。依据16S rDNA测序结果，利用荧光原位杂交实验和免疫组化实验观察阴性和阳性对照NPC瘤内菌是否存在。基于以上研究，作者利用基于16S通用引物的qPCR方法研究了大队列样本中差异菌是否能成为NPC预后因子的潜能，通过对三个队列中的瘤内细菌进行定量区分细菌载量和细菌负荷的重要特征。

接着作者参考 Tamburini FB追踪血液细菌来源的方法（doi:10.1038/s41591-018-0202-8），通过培养组学鉴定NPC肿瘤组织中的菌株。对分离的菌株和来自同一患者的鼻咽拭子、唾液和粪便样本均进行宏基因组测序，并依据高低载量分组的12对临床信息匹配的患者组织样本进行转录组测序，通过宏基因组测序与转录组测序联合分析探究了鼻咽癌微生物群影响肿瘤发展的潜在机制及NPC的预后指标。做肿瘤微生物检测，这些实验设计你都知道吗？

图2 研究设计与流程图

（三）研究发现

1.患者特征

图3 患者基本信息

图4 48对鼻咽癌患者有无肿瘤复发的临床特征

共有802名NPC患者（平均年龄，46.2岁；594名男性，占比74.1%）被纳入本研究（图1）。在发现队列中，96例治疗后肿瘤复发或未复发的患者按性别、年龄、肿瘤淋巴结转移(TNM)分期和治疗方案进行匹配（图4）。三大队列：训练队列、内部验证队列和外部验证队列，其中训练队列的随访时间中位数为83.1（60.3-94.9）个月，内部验证队列为99.0（60.1-108.5）个月，外部验证队列为89.7（56.6-97.3）个月。

2.鼻咽癌组织中存在的微生物群与肿瘤复发相关

图5 鼻咽癌（NPC）组织中与肿瘤复发相关的微生物群

图6 FISH实验和免疫组化实验结果

对3年内复发和5年以上无复发两组96例NPC患者的组织样本进行16S rDNA测序且过滤污染物后（图5C）筛选出差异细菌属。结果表明，变形杆菌（Proteobacteria）在8个门中所占比例最高，棒状杆菌（Corynebacterium）和葡萄球菌（Staphylococcus）在属水平上的相对丰度（分别为12.9%和7.4%）和流行率（分别为81.0%和76.0%）最高（图5A）。值得注意的是，与5年以上无复发的患者相比，3年内复发患者的α多样性显著增强。此外，3年内复发患者表现出普雷沃菌（Prevotella）和卟啉单胞菌（Porphyromonas）水平的显著增加，且在肿瘤复发患者中表现出较高的显著细菌负荷（图5B）。此外，16S rRNA基因探针荧光原位杂交（FISH）和针对细菌脂多糖抗原的免疫组织化学染色分析证实了NPC组织中存在细菌（图6）。除了测序，还有哪些方法能证实肿瘤组织中存在微生物？

3.肿瘤内细菌主要来源于鼻咽微生物

图7 鼻咽癌组织中菌落的分离鉴定

图8 鼻咽癌的瘤内细菌主要起源于鼻咽部

作者通过体外培养的方法成功培养了20个鼻咽癌组织中的15个组织中的细菌，共鉴定出29个菌株（图7）。对来源于同一患者的分离培养的细菌、鼻咽拭子、唾液和粪便样本进行宏基因组测序，通过分析NPC组织代表性细菌和来自可疑位点的菌株之间的单核苷酸变异。结果表明29个菌株与鼻咽（69.0%）、口腔（24.1%）或肠道（6.9%）中的细菌具有单核苷酸变体相似性，其中在鼻咽中的相似性最高，表明瘤内细菌主要来源于鼻咽微生物群（图8）。

4. 鼻咽癌患者瘤内细菌负荷高与预后差相关

图9 高鼻咽癌（NPC）患者瘤内细菌负荷与预后不良相关

图10 较高的瘤内细菌负荷预示着鼻咽癌患者的预后不良

作者对来自3个队列的706名患者的瘤内细菌负荷进行量化，运用X-tile软件获取在训练队列组中获取了区分细菌载量的临界值（206.4），用于将患者区分为低负荷组或高负荷组。

①训练队列：241名患者中193名分配给低负荷组，48名分配给高负荷组。

②内部验证队列：183名患者和50名患者分别被分为低负荷组和高负荷组；

③外部验证队列：164名患者和68名患者分别被分为低负荷组和高负荷组。

生存分析表明，在训练队列、内部验证队列和外部验证队列中，细菌负荷高的患者无病生存率较差（图9），在无远处转移生存率和总生存率方面也发现了类似的结果。单变量回归分析及多变量Cox回归分析显示，在所有3个队列中瘤内细菌负荷与无病生存率显著相关（图10）。

5.肿瘤内细菌负荷与T淋巴细胞浸润呈负相关

图11 肿瘤内细菌负荷与t-淋巴细胞浸润呈负相关

作者通过对具有高或低细菌负荷的12对NPC组织进行转录组测序，结果表明在高细菌载量的肿瘤中细胞周期途径（如MYC和PLK1）和转移途径相关基因显著富集；而低细菌载量的肿瘤组织中差异基因主要富集在主动免疫反应，包括T细胞受体、B细胞受体和干扰素信号等（图11A-B）。通过肿瘤免疫浸润分析显示，低细菌载量的肿瘤比高细菌载量的肿瘤浸润更多的CD8+T、自然杀伤细胞和细胞毒性T淋巴细胞。作者通过数字病理学分析证实，低细菌载量的肿瘤与CD8+T细胞的增加显著相关（图11C）。作者进一步注释了差异免疫基因集，并分析它们与鼻咽癌肿瘤内细菌的相关性。结果表明，大多数免疫相关基因（如CXCL13）的表达水平与肿瘤内细菌（如Porphyromonas）的丰度呈负相关。

（四）研究结论

瘤内细菌负荷是 NPC 患者的有力预后工具，对处于不同恶性进展风险水平的患者的治疗决策具有潜在指导意义。

小结

该研究通过纳入802位NPC患者的样本，从微生物多组学角度分析肿瘤内细菌负荷与无病生存率、淋巴细胞浸润及相关功能基因表达的相关性，揭示NPC肿瘤组织微生物菌可能通过调节肿瘤和免疫微环境来推动NPC疾病进展。其中作者通过培养组学从15个组织中的细菌共鉴定出29个菌株进行溯源，对分离的菌株和来自同一患者的鼻咽拭子、唾液和粪便样本均进行宏基因组测序分析发现瘤内细菌主要来源于鼻咽微生物群。该研究整体文章思路具有最近几年对肿瘤组织微生物研究思路的整合且有创新，值得学习和借鉴。想了解近年肿瘤组织微生物的研究进展请查阅2008-2020肿瘤组织微生物组研究纵览。

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