万字综述：RNA修饰m6A和DNA表观遗传机制之间的关系 | m6A专题
a. 组蛋白、DNA以及RNA上的化学修饰对基因调控本身会有强烈的影响。RNA上一旦出现m6A会导致mRNA稳定性和翻译蛋白等功能发生改变。最近几年的研究表明，当RNA上的m6A修饰响应出现异常时本身也会影响到部分表观修饰位点，反之亦然；
b. 细胞核内颗粒（intracisternal particle）上的RNA甲基化修饰是一种重复元件，对于异染色质形成以及基因组完整性至关重要；
c. 小鼠胚胎干细胞中整体m6A修饰水平丧失，会导致表达染色质相关RNA稳定性增加，这些RNA持续表达会导致染色质更加开放，最终转录整体水平会更加活跃
d. m6A修饰会让表达并翻译组蛋白修饰酶（如KDM6B、CBP和P300）及相关蛋白复合物的RNA变得更加不稳定
e. 组蛋白H3K36me3介导更多的m6A修饰积累（m6A depostion）；
f. 阅读蛋白的识别携带m6A修饰的lncRNA XIST并介导X染色体沉默；
g. m6A的影响超越了mRNA稳定性本身，在生理学以及分子机制研究中应该考虑m6A修饰对RNA产生的功能是如何影响。
基因组DNA层面以及组蛋白水平上发生的可遗传的表观修饰都可以从各个方面影响基因表达。近十年关于mRNA上的表观修饰研究如m6A等，会对动物、植物乃至微生物的RNA表达及翻译，而DNA层面及组蛋白如何影响RNA的m6A修饰以及m6A修饰如何影响DNA及组蛋白，为我们揭开了基因动态调控的另一层神秘的面纱。基因表达非常依赖其精确和同步调节，其核心就是涉及RNA转录本生成及加工的多个checkpoint的复杂相互作用（crosstalk）。细胞间相互作用以及信号通路相互作用可以简单理解为细胞或基因蛋白之间的通讯交流容易引起信号通路内乃至细胞间正常通讯的巨大干扰和影响。
哺乳动物的细胞中有超过100多种RNA修饰，其中最为常见的RNA修饰之一即为m6A修饰。虽然m6A修饰能够影响RNA稳定性及翻译效率，但是近几年有大量研究表明RNA修饰和组蛋白修饰及DNA修饰之间存在复杂相互作用关系。
这些机制的相互作用影响转录本出核、RNA翻译蛋白、染色质修饰酶招募以及m6A甲基转移酶复合物对具体RNA修饰位点的结合能力。
在这篇综述中，作者详细解析和总结了与m6A修饰相关的调节组蛋白修饰以及调节RNA活性的相应分子机制，如lncRNA以及染色质相关调节RNA等。总的来说，这些已发表的研究表明，m6A作为一个多功能checkpoint，可以将不同层次的基因调控机制进行整合。
RNA上特定核苷酸的甲基化修饰被认为是核糖体和转移RNA物种独有的现象。半个多世纪以来的多个研究证据表明，mRNA不太可能发生大量甲基化修饰。细菌mRNA每3500个核苷酸仅含有≤1个甲基化修饰碱基。早期的几项研究用现在看来略显粗糙简陋的工具方法，通过将真核细胞如HeLa细胞等与甲基化标记的甲硫氨酸一起共孵育后，发现仅有极少量的mRNA前体（mRNA precursor）。所以貌似在五十年前，大家似乎认为RNA上m6A修饰似乎与mRNA没有多大联系。
讽刺的是，当发现mRNA上的甲基化修饰中起关键作用居然是是因为另一种被鉴定的转录后修饰。由于真核生物的成熟mRNA携带有一连串A碱基。于是，一种基于多聚核苷酸尾（polyA）的富集方式能够使得研究人员从total RNA中富集到大量的mRNA。不久后Perry和Kelley在Cell上发文称在小鼠的细胞中鉴定到了携带有甲基化修饰的mRNA。部分研究表明核糖体RNA（rRNA）上的碱基修饰成分较为复杂，而mRNA上主要为m6A修饰。
随后的几十年时间里，尽管许多研究人员都知道mRNA上有大量的碱基修饰，但是技术检测手段成为了主要瓶颈。直到2012年来自以色列和美国的两个独立的研究团队分别在Nature和Cell上发表基于高通量测序从全转录水平筛选m6A修饰的mRNA技术，才使得后续的m6A相关研究呈现井喷趋势。特别是何川教授课题组的贾桂芳博士和付晔博士在2011年的Nature Chemical Biology上首次证明FTO具有去甲基化修饰作用，加上测序技术工具的发展，人们越来越对m6A修饰在哺乳动物中重要作用的理解进一步加深。
已知在RNA的160多种修饰中，m6A是丰度最高的一种修饰之一。在诸多mRNA上存在RRACH这种motif中均含有m6A修饰，而RRACH这种motif的含量却远远超过m6A修饰本身的比例，这就暗示着这类额外的“密码”能够超越序列的保守性并赋予m6A这类修饰富集。
此外m6A修饰并不是完全随机的富集在mRNA上的，诸多研究表明大部分m6A修饰富集在mRNA的3’UTR区域附近，包括3’UTR区域本身以及外显子内部。
RNA修饰m6A是一类被称之为甲基化转移酶的蛋白复合物作用所产生的，如METTL3、METTL14、WTAP等10多种蛋白。一旦中间任何一类酶功能出现异常，都会降低整体m6A修饰水平，这对细胞维持基本功能至关重要。
这类甲基化转移酶中METTL3充当催化的关键角色，具备催化活性的结构域，而METTL14虽然不直接介导m6A修饰的催化活性，但是可以充当METTL3的骨架及变构活化剂。WTAP也不具备催化活性，但可以作为引导甲基化转移酶复合物靶向RNA的“领路人”。
有甲基化转移酶就必定会有去甲基化酶，作为一种动态的RNA甲基化修饰，必定可以通过去甲基化酶的作用对已产生m6A修饰的腺嘌呤A进行去甲基化，例如FTO和ALKBH5。尽管来自康奈尔医学院的Samie Jaffrey等认为FTO可能介导m6Am去修饰作用，目前这块领域仍然争议较大。但无论如何m6A参与到了多种生物学功能，如神经调节、免疫激活、代谢调控等。
RNA修饰m6A如何改变mRNA的命运？早在上世纪70年代，已有研究证实在HeLa细胞中mRNA稳定性与m6A修饰相关。mRNA的降解、出核转运及蛋白翻译等功能均与m6A修饰相关。这类功能通常由不同的m6A阅读蛋白所介导的，包括含有HuR结构域以及YTH结构域的RNA阅读蛋白。例如YTHDF2能够选择性结合带有m6A修饰的RNA并介导RNA降解。YTHDF1结合带有m6A修饰的mRNA后能够增强mRNA翻译蛋白的效率。尽管极个别具有YTH结构域的蛋白在功能模式上略有不同，但最近一项研究表明，YTH家族蛋白仅在mRNA稳定性上起作用，并且在HeLa细胞的基因调控作用中具有冗余作用而不是不同的作用。这就意味着是否需要在不同的细胞中这类蛋白行使相似的功能。
RNA甲基化修饰m6A究竟如何改变转录本的命运目前相关研究仍然不多，但是科学家们已经提出了多种机制，包括：① 干扰mRNA的二级结构以暴露或掩盖RNA结合的motif区；② 影响m6A结合蛋白对已产生甲基化修饰的mRNA的亲和力是否发生了变化；③ 减少允许增加亲和力的 RNA 结合蛋白疏水侧链的溶剂化损失；④ 增强相分离……不管这些机制如何，很明显的是RNA动力学改变是m6A修饰影响转录水平的主要机制。
但是凡事都有例外，并且可能出现相反的情况。如IGF2BP家族蛋白通过募集HuR、MATR3、PABPC1以及在应激过程中定位于应激颗粒来增强m6A修饰的mRNA，以促进其稳定性和翻译。因此单个mRNA存在m6A修饰的后果可能是由这种修饰在mRNA的位置、甲基化转移酶以及去甲基化酶之间的相互作用以及所涉及的特定m6A阅读蛋白。
尽管m6A甲基化与RNA稳定性密切相关，但它也与RNA稳态的几乎每个步骤有关，从mRNA前体（Pre-mRNA）加工到翻译效率。一些研究表明m6A甲基化调节Pre-mRNA的剪接。这一证据与细胞核内m6A修饰、甲基化转移酶、去甲基化酶的共定位结果一致，这些酶和修饰会影响选择性剪接。
然而其他研究发现，新生转录本上m6A修饰降低并不是可变剪切的必要条件。同样，其他研究发现m6A甲基化在调节翻译效率中的作用存在相互矛盾的证据。
不同的结论可能是由于用于研究的不同细胞环境和实验模型。总之，有强有力的证据表明m6A会影响转录本的稳定性，但其在影响RNA加工其他步骤方面的精确调控模式，相关研究和相关证据仍然在不断涌现。
一些m6A甲基化酶的敲除实验暗示了m6A修饰可能会影响转录后调控的一些机制。即便是在细胞质中敲除YTHDF蛋白（一种影响RNA半衰期的关键蛋白），也无法完全说明在细胞核中一些m6A甲基化酶的功能，这些甲基化酶如阅读蛋白、甲基转移酶等对发育早期阶段的影响非常巨大。这种影响也有可能会由其他阅读蛋白来补偿，但也说明细胞核中的m6A甲基化酶可能具有独立于细胞质中阅读蛋白去行使功能的作用。
事实上，诸多已发表的研究证实m6A甲基化是通过表观遗传回路（epigenetic circuits）正确反馈来维持RNA产生的组成部分。因此m6A可能与染色质修饰串扰等多种机制都相关，如m6A修饰调控组蛋白或DNA甲基化调控m6A等多种方式。
m6A修饰对异染色质调节的直接影响
异染色质是基因组的重要组成部分，因为异染色质能够维持基因组的完整性并且让基因能够稳定表达。因此异染色质的一个关键功能就是防止被插入微卫星重复序列以及抑制转座子的活性。
在人和小鼠体内，内源性逆转录病毒ERV是一类较为突出的逆转录转座子，换句话说ERV是逆转座子的一个重要分支，需要通过一定的调节机制进行最基本的沉默。
最近有3个课题组各自独立发表了m6A修饰在ERV调节作用，尤其在小鼠胚胎干细胞mESC中是一种被称为IAP的重复序列元件。无论是敲除Mettl3还是对Mettl3催化结构域进行失活，仍然未能恢复H3K9me3水平，这是IAP元素上异染色质所定义的分子特征。相反如果敲除Alkbh5能够显著增加这些位点的H3K9me3水平。紧接着Mettl3催化形成的m6A修饰位点会被阅读蛋白Ythdc1识别，这有助于异染色质形成。Ythdc1的ChIP-seq结果也证实出现了大量的富含H3K9me3的转座子元件富集，以及其在介导逆转录转座子沉默和维持mESC特性中的作用。
IAP的mRNA以及蛋白水平均与m6A水平呈现负相关。IAP mRNA的5’UTR上如有m6A修饰会招募YTHDF蛋白并对其进行降解。从机制上讲，Ythdc1似乎充当Mettl3的重要“向导”，促进Mettl3能够与染色质、Setdb1（一种表观调控因子，沉默和缺失能够造成基因组中参与病毒DNA表达）以及Trim28相互作用，并且反过来调节IAP处的H3K9me3的富集。
除了Setdb1参与外，m6A修饰能够抑制Dux、ESC中双细胞阶段的重要调节因子。某项研究证实当Mettl3和Mettl14都被耗尽时，IAP的mRNA水平有所增加。然而与其他研究结果不同的时，这项研究中H3K9me3水平仅为适度增加。造成这种区别的原因是快速耗尽Mettl3和Mettl14又到了degron（AID）系统。
尽管这些研究结果有所不同，但是提供了翔实的证据证实了m6A修饰与异染色质之间的相互调控关系。
RNA修饰m6A在稳定异染色质方面的另一个作用就是主微卫星重复序列（MSR）。在小鼠染色质中，着丝粒被异染色质占据，而异染色质中就含有MSR，其特征是H3K9me3、HP1蛋白和DNA甲基化。一些MSR可以被Pol II转录，产生的RNA被归类为异染色质RNA也被称为hetRNA。这些hetRNA一旦形成RNA:DNA双链结构，有助于保留HP1和Suv39h，它们是组蛋白赖氨酸甲基转移酶。
MSR RNA，尤其是正义链上与反义链相比有一个特征就是包含有6个RRACH的motif结构。这种RNA结构是METTL3/METTL14复合物的首选底物。在Mettl3/Mettl14敲除的mESC中，MSR转录本上m6A水平出现下降，染色质结合程度受到影响，RNA:DNA双链结构降低。尽管这种现象的生物学效应尚不清楚，但这个研究结果显示了m6A调节染色质结构的另一种模式。
各种各样的RNA种类可以与染色质在生物物理层面有关联，包括启动子相关RNA（paRNA）、增强RNA（eRNA）以及转座子转录的重复RNA。这些与染色体相关的调控RNA（carRNA）已被大量研究证明有助于基因组的组织结构、转录调控和亚核结构域（nuclear subdomains）。
何川课题组、韩大力课题组及高亚威联合发表在Science上的一项研究证明，carRNA上的RNA修饰能够调节局部染色质可及性和下游的转录调控。mESC中Mettl3的缺失增强了carRNA的稳定性，导致染色质更加开放从而使得转录更为活跃。此外这项研究中还发现了活跃转录相关的组蛋白水平出现上调如H3K4me3和H3K27ac。在细胞核中条件性敲除Ythdc1也观察到相似表型，但是细胞质中敲除Ythdf2并未观察到相似表型。
YTHDC1与RBM7、ZCCHC8相关，是细胞核核外泌体靶向（Nuclear Exosome Targeting，NEXT）复合物的关键蛋白。因此该研究表明，METTL3介导carRNA上的m6A修饰，以便通过NEXT复合物被YTHDC1降解。
有趣的是，Mettl3敲除后染色质可及性的增加，通常在这类带有m6A修饰的carRNA中更为普遍，即参与上游调控的carRNA。这个现象在参与维持干细胞干性的基因Esrrb和Ranbp17，以及染色质重塑相关基因Prdm9和Kmt2d基因中观察到了最大的转录效率差异，在打开染色质时形成正反馈回路。carRNA的低m6A水平修饰能够增强组蛋白乙酰转移酶EP300和多功能转录因子YY1的招募。此外低m6A修饰水平降低了组蛋白去甲基化酶JARID2与carRNA的结合效率。
总之这些研究表明m6A修饰的carRNA通过募集失活因子和阻止激活因子来稳定闭合的染色质结构，从而为m6A修饰在基因调控中的作用增加另一个转折点（twist）。
另一种特殊的carRNA，RNA重复序列LINE-1上也观察到了m6A修饰丰度的变化。这些丰度含量较高的反转录转座子在m6A修饰上表现出更加显著的丰度倍数变化。与其他carRNA相似的是，LINE1在Mettl3敲除后整体含量上升（携带m6A修饰的LINE1更容易被Ythdf2降解），并有助于全基因组层面的染色质可及性事件增加。dCas13b-FTO 融合蛋白也从另一层面验证了这种LINE1介导染色质可及性事件增加现象。
以上这些现象均证实了m6A修饰可以调节carRNA调控染色质可及性，并影响下游转录效率的现象。
一些调控组蛋白修饰的蛋白，其mRNA上也存在诸多m6A修饰位点，例如组蛋白乙酰转移酶P300/CBP的mRNA携带有m6A修饰后其稳定性降低继而调节神经干细胞中的基因表达。Mettl14的缺失与发育异常有关，包括增殖减少和过早分化。通过m6A测序发现，在Mettl14纯合子敲除小鼠中，CBP和P300的mRNA表达量与野生型小鼠相比显著增加而m6A水平则下调。CBP和P300的不稳定由m6A介导继而影响组蛋白活性最终导致染色质结构发生改变。
两个关键的组蛋白H3K27ac和H3K4me3与基因表达激活相关，而H3K27me3则与基因表达抑制相关。小分子Ezh2抑制剂GSK343治疗下，补救了部分功能丧失细胞的增值缺陷。尽管 P300/CBP 在基因启动子和增强子处介导 H3K27 的乙酰化，但尚不清楚这些因子的变化如何具体影响组蛋白的甲基化状态。
值得注意的是PRC2组分甲基化状态的变化，这暗示着一定有一个关于m6A调节组蛋白修饰的独特机制。
尽管如此，诸多证据表明m6A修饰可以通过改变影响组蛋白化学修饰或影响组蛋白修饰酶的mRNA稳定性，来改变其下游转录稳定性。
来自中山大学中山医学院赵蔚课题组曾在Science Advances发表一项关于细菌引起炎症反应的研究，结果表明m6A修饰可以调节无节制的炎症。当m6A阅读蛋白YTHDF2缺失时，组蛋白去甲基化酶KDM6B的转录本稳定性会增强，从而导致KDM6B翻译能力增强，继而一些编码促炎症细胞因子如IL-6、IL-12B和ICAM1位点上H3K27me3的水平降低。相反H3K27me3的低甲基化水平增强反过来又增加了炎性细胞因子的转录水平，m6A和H3K27me3之间双向串扰充当控制炎症基因表达的关键调节检查点。
在另一个实验中，赵薇课题组发现热灭活鼠伤寒沙门氏菌HKST处理的THP-1细胞中，m6A测序结果中m6A的peak主要集中在H3K27me3较为稀疏的区域。GSK-J4对KDM6B的化学抑制也能降低整体m6A水平，且METTL14和KDM6B位点的蛋白互作结合受损，形成负反馈回路，继而通过调节KDM6B的稳定性来调节H3K27me3的水平。
因此，去甲基化酶KDM6B严格调节H3K27me3的沉淀可阻止m6A修饰积累。总之H3K27me3对METTL3/METTL14的共转录招募至关重要。
METTL3/METTL14复合物对抑制性组蛋白H3K9me2有一定的调节作用。
近期一项研究在Flp-In HEK293细胞中使用了一种四环素诱导型报告基因的筛选系统，直接研究了m6A对组蛋白修饰的影响。报告系统含有了两种质粒，一种具有m6A经典motif GGAC重复序列，另一种是GGTC重复序列作为对照。四环素处理后分析诸多组蛋白修饰水平，与对照组相比，H3K9me2出现大幅度降低，H3K27ac和H3K27me3轻微上调。METTL3或METTL14的缺失增加了H3K9me2的整体水平，并且这种上调被野生型 METTL3的诱导表达逆转。
阅读蛋白YTHDC1募集KDM3B使H3K9me2（通常是抑制标记）去甲基化。YTHDC1与KDM3B互作，并且大部分内源性YTHDC1与细胞核内的KDM3B共定位。Ythdc1敲低还显示与METTL3 D395A（突变）类似的KDM3B与染色质结合的减少。
此外YTHDC1特异性靶向并局部增加了KDM3B的风度继而降低了H3K9me2的水平。KDM3B靶向的基因和m6A修饰的基因出现较大的重叠度。
长链非编码RNA（lncRNA）是表观遗传机制的关键调节因子。Xist的表达，可以说是最具特征的lncRNA，“覆盖”女性的X染色体以沉默基因表达。因此，Xist对于维持两性之间的剂量补偿至关重要。
Xist上携带有大量m6A修饰，Xist与RBM15和RBM15B相结合，是通过将m6A甲基转移酶蛋白复合物引导/招募至RNA来实现基因沉默。CO-IP结果显示RBM15/RBM15B和METTL3之间以WTAP依赖性方式存在稳健的相互作用。单独敲低RBM15 或 RBM15B并未能够影响Xist调控目标Gpc4和Atrx的表达，而Rbm15/Rbm15b双重敲低导致会让原本被沉默的Gpc4和Atrx转录水平显着增加。
这些结果表明RBM15和RBM15B具有冗余功能。此外，Rbm15/Rbm15b的敲低显着减少了XIST上的m6A修饰水平，这一结果与METTL3的敲低结果是一致的。阅读蛋白 YTHDC1对于Xist上的m6A识别和下游转录沉默至关重要。
总之RBM15/RBM15B将METTL3-WTAP复合体募集到XIST，然后靶向XIST进行m6A修饰催化作用。此外，XIST的相关工作将m6A定位为生理基因沉默的动态调节因子，并且lncRNA的m6A甲基化状态可能对其功能至关重要。
越来越多的研究证实m6A修饰与染色质及组蛋白修饰彼此之间相互作用。其中H3K36me3是一种典型的转录延伸标记，主要附近在编码区CDS及3’端非编码区，可以影响m6A修饰富集。之前多个已发表的研究都表明，H3K36me3在m6A的peak附近显著富集。
这种分布也规律，也与H3K9me3和H3K27me3 主要存在于异染色质中的观察结果一致，当然异染色质中的转录活性本来就很低。在各类正常细胞以及癌细胞中，H3K36家族的组蛋白甲基转移酶SETD2的mRNA表达与METTL3、METTL14和WTAP的表达呈正相关。SETD2的敲低或组蛋白去甲基化酶KDM4A的过表达显着降低了整体m6A水平如MYC（较早发现的一组癌基因，包括C-myc，N-myc，L-myc等）和ACTB（一种管家基因，表达β-Actin蛋白）。
使用靶向基因组异位位点的无催化活性的CRISPR/dCas9融合蛋白来测试H3K36me3和m6A修饰之间的因果关系。将dCas9-KDM4A靶向MYC的编码区不稳定决定因素(CRD)区域，其中H3K36me3被富集，导致H3K36me3水平和m6A水平大幅下降；相反，将dCas9-SETD2靶向没有H3K36me3的GNG4，会导致H3K36me3水平和m6A水平增加。
此外，各类已发表的研究均证实METTL14是m6A甲基转移酶蛋白复合体中识别和结合H3K36me3的关键蛋白，ChIP-seq、PAR-CLIP-seq以及m6A测序结果中的Peak均显示，METTL14结合位点、m6A修饰以及H3K36me3结合位点重叠度非常高。
在胚胎干细胞mESC中，多西环素诱导的Setd2敲低导致m6A修饰水平下降，如在其他细胞类型中所见，以及多能性因子Oct4、Sox2和Nanog的mRNA水平和蛋白水平均上升。
总的来说，这些研究均证实H3K36me3引导m6A甲基转移酶蛋白复合物与延伸转录本结合并共转录甲基化新生RNA这个模型的成立。
近年来，m6A机制研究及其他下游应用的研究发表数量呈现激增状态。越来越多的证据证实了m6A在调控基因表达和疾病进展方面的重要性。虽然m6A与表观遗传学之间的关系并不是RNA甲基化研究领域最初的焦点，RNA甲基化与其他表观遗传调控因子之间的相互作用近些年受到了越来越多的关注。
同时这个领域产生了若干个非常有趣的前沿问题，值得后续的研究人员去挖掘。了解这种相互作用或串扰中的依旧存在的问题，从而导致各种类型疾病的发生发展是非常有趣的问题。
例如，当ERV的调节功能发生改变时，与一些发育异常、肿瘤进展乃至神经变性均息息相关。这些疾病或发育上的异常都与m6A高度相关。因此m6A甲基转移酶复合物所展现出来的表观遗传学机制，有助于我们更加深刻理解发育及疾病发展机制。尽管目前已发表的大部分研究仍然集中在编码蛋白的RNA转录本上的m6A修饰现象，但是m6A修饰在非编码RNA上的作用，我们仍然只是窥探了其中的冰山一角————
① 非编码RNA的m6A修饰在基因调控中的作用是什么？能否有新的互作组（interactome）测序技术将提供更高的分辨率来研究非编码RNA上m6A修饰现象，并在下游多个研究领域被应用？
② m6A修饰如何在RNA转录本上具体精确的位置上富集，并且与不同的基因调控层面进行整合研究？
③ 最近的证据表明，m6A修饰是抑制ERV异常转录活性所必需的关键因素，这表明METTL3对异染色质结构的影响可能是其在生物体发育中的作用的基础。然而，异染色质依赖与独立效应对哺乳动物生理学的相对贡献是什么？不同细胞和条件下异染色质形成的差异是什么？甲基化转移酶蛋白复合体如何与异染色质的转录启动子相互作用？
④ 除了m6A修饰之外，还有其他RNA修饰可以反馈到表观遗传检查点吗？
⑤ m6A修饰对表观遗传整体层面的影响在一系列条件和细胞类型下是否持久？它们是否能克服转录物稳定性或基因翻译方面的不和谐效应，或者它们的生物学效应是否更微妙？
⑥ Xist上的m6A甲基化残基连接其他促进转录抑制的蛋白质。RBM15和YTHDC1等协同因素的结合如何导致基因沉默？是否有其他调控RNA利用RNA修饰位点作为诱饵或指导表观遗传因子的结合？
⑦ 鉴于新技术方法的发展，使得针对具体某条携带修饰的RNA靶向技术在in vivo水平成为可能，我们能否利用这些技术在表观遗传整体层面来改变疾病状态？
其中何川教授2023年的Science主刊文章已经针对第②个问题，做出了部分解答。
常规的m6A测序方法以m6A抗体为主的IP类测序结果中存在大量的噪音，特别是非编码RNA转录本往往在total RNA中含量极低且寿命短（稳定性差），急需一些新的测序技术来改善碱基的分辨率并提供更为详细的化学定量分析。
鉴于非编码RNA在表观遗传调控中具有非常重要的调节作用，随着测序技术的不断进步该领域的进一步探索可能会继续产出一系列高质量的研究。
前些年大部分m6A研究所使用的测序方法为m6A-seq或MeRIP-seq，这类方法需要非常高的RNA起始量，早些年甚至是需要200μg甚至是更高的total RNA。这些年随着技术的发展，IP类的m6A-seq已经降低到了1μg，但是仍然对诸多样本有限制，如分选后的免疫细胞、患者的珍贵临床组织、原代细胞等。开发超低起始量的测序方法，将碱基分辨率从原来的Peak变为单碱基也会大大推动m6A领域的发展。
此外，使用CRISPR及相应衍生技术如融合蛋白等，继而通过CRISPR介导的精准靶向RNA修饰或去修饰作用可以阐明RNA甲基化修饰和染色质动力学之间的关系。例如近期有大量研究都采用了dCAS13系统与甲基化转移酶蛋白复合物（METTL13/METTL14等）组成融合蛋白去精准靶向RNA并实现位点精准靶向m6A修饰的作用，或构建YTH-FTO融合蛋白实现靶向RNA精准去m6A修饰作用。这些研究都有最小的脱靶效应，为后期临床上的应用提供了新思路。
单细胞测序技术现在也正在慢慢从转录组测序拓展到其他领域，例如DART-seq基础上改进的scDART-seq就是在单细胞层面开展m6A修饰的方法学文章，这些单细胞层面开发的新技术将会继续带领我们探究m6A修饰在不同细胞之间的异质性和空间水平差异。
最后，尚不清楚m6A如何在不同情况下对表观遗传控制产生看似相反的影响。它可以使染色质或多或少易于接近，以及增加或减少转录和翻译。尽管已发表的研究数量和深度都在增加，但显然仍需要研究人员继续探索m6A修饰更为深层次的分子机制。
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