国自然2023热点——m6A！知识点合集帮你梳理好了（附20-21年国自然清单下载）| m6A专题

2023年国自然申请即将拉开序幕，是否还在为如何申请基金发愁呢？作为当红炸子鸡，m6A修饰已经从过去的无人问津，到现在的人人知晓。

即便如此，m6A国自然标书的基金申请仍然如火如荼，接下来我们将从几个维度帮各位老师梳理一下，想要基金标书成功上岸的几个因素。

究竟要不要做预实验？前期在测序前要做哪些工作？自己做的课题是否会过时？如何申请课题才能受到专家的青睐？有哪些前沿方向值得深入研究…………看完这篇推文你会思路清晰

文末有福利，这边会附上2020年-2021年所有中标的m6A基金标书清单，转发朋友圈获取50个点赞即可。

1. Pubmed上发文规律总结

我们以2022年10月刚公布的SCI影响因子来作为标准，在Pubmed上以“m6A”和“RNA methylation”作为关键词后我们发现，截止到本文发稿，今年1-10月份仍然有超过1600篇m6A相关研究发表，其中>10分的研究仍然有300多篇，占比超过21%。

当然这其中的规律出现了一些小小的变化。早些年肿瘤领域的基础研究文章较多，从前年开始到去年，发表的文章标题中直接显示m6A甲基化越来越少，开始重新聚焦到生物学故事本身。其他研究包括植物学等前些年小众领域目前也有越来越多的闯入者。

所以从目前发文整体趋势来看，每年仍然在2000篇左右，未达到“烂大街”程度。

2. 国自然基金申请数量和金额简析

国自然m6A资助金额曾经从2018年-202年呈现出几乎100%增长率，尤其是2020年的增长率达到了107%。从资助方向来看，2020年后呈现出不同方向百家争鸣的局面。

值得注意的是，医学部在总资助项目和额度上占据了绝大部分比例，而截止到2021年每年生命科学部获批的项目个数为37个，总资助额度1528万，整体占比仍然不足15%。

生命科学部主要涵盖微生物学、植物学、动物学、生物物理与生物化学、生物材料、农学基础与作物学、植物保护学、园艺学与植物营养学、畜牧学、水产学、食品科学等各个方向。所以对于非医学方向的老师来讲，目前m6A仍然大有前途。

那么是不是医学现在无法申请到好的课题了呢？也非绝对！医学领域需要各位老师放弃“蹭热点”的幻想，扎扎实实将自己的课题逐渐推进至深水区。

3. 哺乳动物与植物相关的三类m6A甲基化酶小结

目前无论是哺乳动物还是植物，m6A的三类甲基化酶几乎没有出现太大变化，这边也帮老师进行了简单的总结。如上图所示。

4. 哺乳动物及植物中m6A调控机制

目前哺乳动物中m6A调控机制中几个比较常见的甲基化酶都为经典的调控方式，而植物中甲基化阅读蛋白目前仍然还在不断被挖掘中，ECT家族仍然有新的酶被鉴定出有相应功能。

植物相关m6A综述解析：

哺乳动物m6A综述解析：

5. m6A研究三步走究竟还有必要？

m6A测序前预实验

↓

m6A测序挖掘差异相关基因

↓

后期功能验证

上述步骤为经典的m6A研究三步走，但是现在其实大部分研究直接从第二步开始。

尤其是前期的预实验，并未必要检测整体m6A水平，如质谱法、ELISA酶标仪以及Dot Blot等。详情请点击：都2021年了整体m6A水平没差异也能做m6A测序 | m6A专题。

那么假如非得做预实验的话，三类检测方法孰优孰劣呢？

① Dot Blot目前文章用的比较多，尤其是一些侧重点在生物化学和基础医学研究的论文，这类图一般都会放在论文的第一部分。虽说Dot Blot方法比较复杂，条件摸熟练后做出来结果会非常漂亮。在这边还是强烈推荐！

Dot Blot参考文献：Nagarajan., et al. (2019). Dot Blot Analysis for Measuring Global N6-Methyladenosine Modification of RNA: Methods and Protocols.

② 酶标仪的最大优势是成本低速度快，3-4小时就能出来结果，三种方法里精确度较差但也是性价比较高的一种检测方法。需重复多次。不作为首要推荐检测方法

酶标仪参考资料：EpiQuik m6A RNA Methylation Quantification Kit P-9005

③ LC-MS/MS是目前最靠谱的金标准，强烈推荐。

参考文献：Bifeng Yuan (袁必锋)  (2017) Liquid Chromatography-Mass Spectrometry for Analysis of RNA Adenosine Methylation. Methods in Molecular Biology

6. 有条件开展预实验，动植物一般需要做哪些工作？有哪些注意事项？

以肝癌这篇发表于2018年的研究（详情点击：案例解析：METTL3上调肝癌中m6A水平引起YTHDF2介导SOCS2降解 | m6A专题）为例，在Huh-7和HepG2细胞系中敲低METTL3后，抑制了细胞增殖和迁移。在裸鼠中敲低METTL3，肿瘤组织重量减轻了。METTL3敲除能够显著抑制小鼠肝肿瘤微环境中肿瘤形成，裸鼠肺转移减弱。过表达（CRISPR-dCAS9）后细胞和动物实验结果相反。METTL3可能在HCC中具有促癌作用。

在植物方向，拟南芥、草莓、番茄等植物作者均构建了突变体用于早期的表型研究。详情请点击：

基因敲除/敲低/过表达一些Tips：

• siRNA进行瞬时干扰一般效果持续48-72h，注意及时收集细胞，有条件进行WB检测

• shRNA稳转株建议同时设计2-3种不同shRNA，作为生物学重复

• CRISPR-cas9稳转株可能会导致致死敲除现象，传代难度大，可换其他方式

• 过表达有条件使用dCas9激活系统，过表达倍数不要超过10倍。传统过表达非生理状态

• 细胞系较难获取，可在小鼠上进行敲除。推荐使用Cre-LoxP，选择特定时间和空间表达的特异性基因来激活需要敲低/敲除/过表达的基因

• 部分植物无法构建突变体，可在模式植物开展如烟草、番茄、拟南芥等

7. 一些新兴的m6A测序技术值得尝试吗？

目前除了非常经典的MeRIP-seq外，还有一系列新兴的m6A测序技术如MazF-m6A-seq、Nanopore Direct m6A-seq以及其他近乎于单碱基分辨率的测序技术。

可以负责任地说，这些新技术目前许多仍然仅停留在论文阶段，无论是检测稳定性还是实验的便易程度都不如MeRIP-seq（也叫m6A-seq）。如MazF酶切只能识别ACA motif的RNA，而Nanopore在识别碱基修饰上仍然存在较高的错误率。

8. 如何快速锁定m6A科学问题？

如何从自身课题去切入m6A修饰——如何讲好m6A的故事？具体包括：

① 2020年前，由好的表型及现象反推到m6A ，如肿瘤转移、耐药、水稻抗虫等，查看下游出现m6A修饰差异的基因和其主要作用的酶。一个好的故事是最关键的

② 2020年后，一个好的现象无需m6A相关的一些预实验，如无需看整体m6A水平，只需看阅读蛋白这些酶是否差异表达（RNA和蛋白水平），直接进行下游m6A测序（详情请点击：都2021年了整体m6A水平没差异也能做m6A测序 | m6A专题）

③ 如果无法直接锁定m6A三种甲基化酶，可采用大海捞针法即直接通过敲除或者条件性敲除挨个儿对上述提到的甲基化酶进行操作（Cre-LoxP系统、CRISPR、shRNA稳转株、siRNA瞬转、农杆菌转染等），然后观察表型变化。

④ 进一步锁定核心基因和明星分子，一般都是起关键作用的明星分子，如肿瘤细胞侵袭与凋亡、水稻产量、肉脂肪含量等基因实际上是固定的几个明星分子。许多课题组基础雄厚，围绕某一现象或某积累基因不断拓展，将m6A修饰、转录因子、组蛋白修饰、lncRNA/circRNA与课题组基因相联系

⑤ m6A修饰→分子A→分子B→现象C为讲故事逻辑闭环，需要辅助各类实验

m6A整体水平无差异也可以做m6A测序？——Genome Biology案例展示：

如上图所示，第一步作者通过质谱发现，m6A整体水平仍然无较大差异。但是后期仍然在草莓的m6A测序结果中挖掘到了与成熟相关的基因。详情请点击：案例解析：草莓m6A修饰调控ABA通路介导果实成熟机制 | m6A专题。

9. 后期课题申请建议及趋势

我们大致把国自然基金标书申请分为3个大的阶段。第一阶段为蛮荒阶段，这个期间课题但凡和m6A稍微有一些挂钩，就非常容易获批，当然竞争也不是特别激烈。该期间申请课题单位和方向，农口尤其是植物方向获批项目几乎没有或以拟南芥等模式植物居多。当然肿瘤口径依旧是竞争非常激烈的方向。无论如何，该阶段m6A测序是主力，许多研究在机制挖掘这块并未涉及太深。研究主角仍然还聚焦在甲基化转移酶、去甲基化酶居多，如METTL3以及FTO等。

第二阶段，医学开始慢慢从肿瘤往其他领域拓展，而植物方向也慢慢有更多的项目来申报。这个阶段测序慢慢从主角变味了配角，无论是标书还是已发表的研究中，实验篇幅占比大幅度增加。无论是甲基化转移酶还是去甲基化酶，都会配合下游的阅读蛋白展开一系列研究。而且下游机制也越作越深。

第三阶段，无论是农学还是医学，基金标书申请创新性也在不断增强。单纯以蹭热点方式的临时拼凑型很容易被评审专家枪毙。而下游的经典分子也极其容易沦为套路研究使得创新性不足。这个时候，深水区如何突破？一方面m6A研究在临床角度开始往转化医学转换，例如靶向抑制剂对应表型研究、遗传群体易感人群相关m6A-QTL定位等。基础研究这块，表观生物学开始崭露头角，如组蛋白修饰、DNA甲基化等。动植物方向，无论是植物、园艺、作物方向还是兽医、动物育种方向，关注物种经济性状本身服务于生产等接地气的研究方向越来越受到青睐。

所以后期课题申请方向，建议可以往这几个方向考虑：

① 农学（实用性农艺性状）：

• 动物肉类品质和脂肪生成

• 植物抗胁迫性状以及产量

② 医学及药物学：

• 高效Vehicle递送m6A抑制剂，如外泌体、LNP、金属纳米材料、高分子材料等

• 孟德尔随机化与正向遗传学，m6A-QTL等

• 药物靶点和标志物挖掘

③ 基础生化：

• 表观调控和表观修饰，如组蛋白、染色质开放程度、超级增强子、转录因子

• RNA代谢与修饰效率

• 新型测序方法开发，如单碱基m6A测序新方法或单细胞m6A测序等方向

10. 部分经典及非经典m6A案例解析

明星分子mTORC1（Rapamycin complex）作为真核细胞中高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合物，可以在生长因子、营养因素等调控下，促进细胞生长，抑制自噬等重要过程。目前主刊或者大子刊的研究，越来越把m6A作为配菜，而主角则重新会聚焦到自己想要研究的分子。

上述两篇已发表的Molecular Cell论文中，m6A修饰对明星分子mTORC1的调控机制，这两篇文章均打破了传统Writers、Erasers、Readers套路作者都把目光聚焦到了mTORC1分子，并围绕这个分子展开一系列研究。

另外，SAM底物也是m6A研究的另一个思路，详情请点击：用户案例Adv Sci(IF=17)：锻炼改变大脑m6A修饰缓解压力诱导的焦虑 | m6A专题。

福利时刻1

2020年和2021年，联川生物小编帮各位老师梳理了522个获批的m6A国自然清单。转发本条朋友圈，超过50位朋友点赞无分组，在后台回复点赞截图，即可获得这份国自然清单，为大家课题设计提供更加开拓的思路。

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