于君组是如何讨论肿瘤内微生物异质性及与突变的关系 | 肿瘤微生物组

论文标题：Microbial Community Heterogeneity Within Colorectal Neoplasia and its Correlation With Colorectal Carcinogenesis

刊登日期：2021年04月

发表杂志：Gastroenterology

影响因子：33.88

技术手段：16S rRNA基因测序

（一）研究背景

饮食模式和生活方式与发生结直肠癌（CRC）的风险增加有关，生活方式因素与宿主遗传背景可以通过改变其组成和功能特征来影响微生物群，这些变化可引起微生物群落组成失调和结直肠癌的发展。肠道微生物失调在CRC的发生发展中起关键作用，然而结直肠肿瘤内微生物群及其与CRC进展的关系仍不明确。

（二）研究思路

图1 研究思路

（三）研究发现

1. 微生物组研究队列及总体特征

图2 微生物群落的总体特征

作者收集了21例CRC患者和20例结直肠胰腺患者共266个活检组织，每个患者均取自肿瘤组织的4-6例活检样本和相邻正常组织2例活检样本。通过16S rRNA基因测序研究了肿瘤组织微生物群组成差异，发现在两个队列中α-多样性和β-多样性有显著差异，但是瘤变与相邻正常组织的微生物多样差异不显著（图1A-B）。

接着作者从微生物特征（菌群组成、菌群相互作用等）评估结直肠癌和结直肠腺瘤之间差异，疾病状态（CRC或结直肠腺瘤）对两个队列中微生物特征的差异有显著影响，与腺瘤患者相比大多数CRC患者样本中梭杆菌（Fusobacteria）丰度增加，CRC患者样本中厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）分别占比35.68%和19.53%，但腺瘤患者的菌群中变性菌门（Proteobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes）分别占比32.16%和22.21%（图1C）。

2.结直肠肿瘤内微生物群落的异质性

图3 肿瘤内微生物群落的异质性

作者通过对单个瘤变患者的活检组织不同区域（瘤变-11例与正常组织-10例）内微生物群落的异质性进行评估，在不同CRC患者的肿瘤活检组织中都有自身的微生物菌群组成（图3A）。接着作者对CRC患者的微生物图谱进行分析，网络作图分析显示不同微生物富集肿瘤内特定部位（图3B-C）；同样，在所有腺瘤患者的肿瘤活检中微生物群落组成存在显著差异（瘤变-10例与正常组织-10例）。为确认瘤内微生物异质性不是人为技术因素影响，作者在瘤变不同患者的额外采集了同一部位57例活检组织进行微生物组分析，对于同一部位的微生物组成相似，其微生物丰度的变化明显低于来自肿瘤不同部位的微生物丰度。以上结果为单个结直肠瘤或非恶性腺瘤内微生物异质性的存在提供了证据。

3.瘤内微生物异质性与腺瘤-癌演变顺序

图4 瘤内微生物异质性与腺瘤-癌演变顺序

为检验癌内微生物异质性与结直肠癌发生之间存在的相关性，作者选择丰度变异较大的微生物（%CV＞50）为高变量微生物（HVMs）；在两个队列中CRC组织中鉴定出156个HVM，腺瘤组织中鉴定出203个HVM，显著高于CRC组织（图3A-B），表明癌内增生HVM可能沿着腺瘤-癌序列减少。通过将瘤变内丰度与瘤变状态相关的微生物进行分组，建立了5个子群落（图4A）。其中，队列1的子群落1（c1-1）由CRC富集的HVMs组成，c1-2由CRC和结直肠腺瘤中富集的HVMs组成；CRC富集中c1-1中超过一半的HVMs属于Firmicutes（54%），结直肠腺瘤富集的c1-2主要是Proteobacteria（43.14%）。另外，HVM在c1-1（CRC富集）和c1-3（CRC和结直肠腺瘤均富集）中的分布可以在队列2中c2-1和c2-3中得到验证（图4B-C）；c1-1和c2-1的HVM相似度为40%，c1-3和c2-3相似度为63%（图4D）。以上结果表明腺瘤-癌微生物群落发生了变化。

接着，作者检测了15例CRC患者和12例结直肠腺瘤患者邻近正常组织中的丰度变异较大的微生物分布，结果显示结直肠癌中78%的HVMs和结直肠腺瘤中88%的HVMs在邻近正常组织中未观察到；此外，CRC邻近正常组织与结直肠腺瘤邻近正常组织间的微生物种类相似。在CRC进展过程中，非癌变组织中的CRC/结直肠腺瘤相关微生物的丰度变化不显著。

4.个体高变异微生物与腺瘤-癌序列的相关性

图5 腺瘤-癌序列中HVMs变异的变化

鉴于观察到的变化，作者推测每个HVM的丰度在结直肠癌发生过程中可能会发生变化，微生物丰度的变化沿腺瘤-癌序列改变（图5A）。一些在结直肠癌肿瘤内特定区域富集的微生物沿腺瘤-癌序列的丰度变化增加，其他一些在腺瘤特定区域富集的微生物沿腺瘤-癌序列的丰度变化减小。为了确定个体HVM与CRC进展之间的关联，作者通过比较每种HVM在CRC肿瘤与腺瘤中的丰度变化并计算出每种HVM的FDV（平均变异百分比系数的倍差），若FDV＞1意味着瘤内HVM丰度的变化从腺瘤上升到癌。其中，方差增加的HVMs总量（n¼19）略高于方差减少的HVMs（n¼16），队列1生成的数据可由队列2验证得到（图5B）。与CRC相关的属拟杆菌（Bacteroides）、微单胞菌（Parvimonas）以及梭菌科(Clostridiaceae)被鉴定为变异增加的HVM，普拉梭菌（Faecalibacterium）、罗氏菌（Roseburia）和链球菌（Streptococcus）被鉴定为变异较少的HVM。综上，个体微生物丰度的瘤内变异可以沿着腺瘤-癌序列变化。

5.肿瘤内微生物群与宿主基因KRAS突变和微卫星不稳定性（MSI）的相关性

图6 肿瘤内微生物群落与宿主基因突变的相关性

在所有的活检组织中同时检测KRAS突变和MSI（KRAS突变会改变代谢途径，如糖酵解和氨基酸可用性支持肿瘤细胞的生长和存活），利用RI分类器可以显著区分KRAS突变和无KRAS突变CRC组织中的微生物群落，结果显示共有26种微生物与KRAS突变显著相关，Bacteroides是与KRAS突变正相关最显著的属；对于腺瘤，KRAS突变和未突变腺瘤组织中的微生物群落显著分离，其中消化链球菌（Peptostreptococcus）和梭状芽孢杆菌（Clostridium）与KRAS突变显著相关（图6A-C）。存在MSI突变和无MSI突变的CRC组织中的微生物群落显著分离，38个微生物与MSI表现出较强的相关性，大多数属于Proteobacteria。因此，作者发现在宿主基因改变的组织中存在不同的瘤内微生物群。

图7 KRAS突变阳性的结直肠癌患者的细菌图谱

图8 MSI阳性的CRC患者的细菌定位

接着，作者评估了宿主基因突变与肿瘤内异质性微生物群之间是否存在相关性，KRAS突变阳性的CRC患者的细菌图谱显示肿瘤内存在不同的微生物组成(图7A-B）；基于MSI阳性肿瘤活检的CRC患者的细菌图谱显示肿瘤内也存在不同的微生物群落(图8A-B）。对单个微生物而言，26个KRAS突变相关微生物中有22个（85%）被鉴定为HVMs，38个MSI相关微生物中有28个（74%）是HVMs(图6D)。以上结果表明，>70%的突变相关微生物具有较大的瘤内丰度变化。

（四）研究总结

该研究确定了CRC和腺瘤中微生物群落结构及其在CRC发生发展中的作用。研究纳入36例CRC患者和32例腺瘤患者，肿瘤及其邻近正常组织均取多个样本（2-6例肿瘤和2-5例邻近正常组织），并通过16S测序进行检测，随后分析了微生物群的多样性和异质性以及肿瘤微生物失调和宿主基因改变（KRAS）、微卫星不稳定（MSI）之间的相关性。研究发现瘤内菌群存在异质性，CRC相关病原菌（Fusobacteria、Bacteroides、Parvimonas和Prevotell）的组成和丰度在同一肿瘤的不同部位存在差异。这种异质性与CRC进展的相关性揭示肿瘤内菌丰度的变化引起微生物群结构的改变。此外，在同一肿瘤内丰度变化较大的微生物其种类和在瘤内的丰度变化程度随CRC进展而改变。瘤内微生物异质性还与CRC相关的宿主基因突变（KRAS突变和MSI）显著相关。本文证明了肿瘤内微生物群是异质性的，并与CRC的发生相关。

相关阅读

点击下方图片进入云平台资料汇总：

所见即所得，绘图高规格联川云平台，让科研更自由