联川用户文章3连发：组织与瘤内微生物组5R 16S测序该怎么玩 | 微生物专题
几个世纪以来，微生物在癌症组织形成、诊断、预后和治疗中的作用一直存在争议。最近的研究挑战性地声称，细菌、病毒和（或）真菌在癌症中普遍存在，它们是癌症免疫治疗的关键因素，可以通过工程手段治疗转移（Science：1526份7类肿瘤组织实证肿瘤细胞和免疫细胞中存在细菌 | Nature：Rob Knight团队发现血液和组织微生物组可诊断癌症)。微生物不仅存在于肿瘤组织中，在人们的血液和常规组织中也存在着微生物（详情见：人的血液中有微生物吗？）；血液和组织中微生物是低生物量，这些样本中呈现出很高的宿主与细菌DNA比率，这会导致基于扩增子策略的16S rRNA基因测序受到宿主DNA干扰，引起菌群序列PCR扩增效率降低，甚至扩增失败；若使用宏基因组测序，如不能对菌群DNA先进行相应地富集操作，将难以得到菌群的基因序列。
不同于高生物量的肠道菌群，由于组织内的微生物生物量相对较低，并且肿瘤的宿主与细菌的DNA比率很高，与之对应的培养方法也未知，再加上容易受到外部污染，长期以来，表征肿瘤组织微生物群一直是一个挑战（做肿瘤微生物检测，这些问题需重视！）。下一代测序技术的发展和进步，特别是以检测微生物标记基因（如16S v3-v4区域）为对象的扩增子测序的广泛使用，使得人体微生物群的鉴定驶上了快速道，包括许多基于培养法无法检测的微生物也被快速鉴定出来（微生物16S测序数据的正确打开方式）。最近出现的优化升级版16S测序——5R 16S测序，即对16S rRNA基因上的五个区域（V2、V3、V5、V6、V8）进行多重PCR扩增和测序（图1）。与V3V4区扩增策略相比，此方法扩增出的区域覆盖约68%的16S全长序列，可以大幅提高细菌物种检测的覆盖率和分辨率，尤其适合于低生物量的微生物样本检测[3]。不仅如此，5R 16S测序还能兼容有一定程度降解的FFPE样本。
图1 5R 16S扩增16S rRNA基因的5个区域（灰色）
我们已将5R 16S测序技术用于数千份肿瘤组织样本（包括几百份FFPE样本）的瘤内细菌群的检测，包括头颈癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌、结直肠癌、胰腺癌、前列腺肿瘤、宫颈癌等（部分为FFPE样本），还有非癌组织包括脑组织、鼻部息肉、消化道粘膜、胸腺导管、肺组织、肝组织、皮肤组织等，以及乳汁、血浆、血清、白细胞、子宫内膜拭子等，整体的检测效果令人满意。由此可以得出，5R 16S测序不仅适用于组织微生物的检测，也适用于其他微生物生物量较低样本的检测。接下来通过几篇联川生物的用户文章给大家介绍5R 16S测序在组织和瘤内微生物组的研究应用。
01ACS Nano：静脉给药活体细菌以引起肿瘤焦亡和抗肿瘤免疫响应发表期刊：ACS Nano
影响因子：18.027
发表时间：2022.05
研究方法：5R 16S测序，RNA-seq
样本类型：肿瘤组织
研究目的：通过改造李斯特菌（Lmo@RBC）开发一种新的免疫治疗系统并验证其功效
本研究通过对小鼠静脉注射PBS、Lmo（单核细胞增生李斯特菌）或Lmo@RBC（改造后的单核细胞增生李斯特菌）来比较肿瘤免疫治疗效果，并借助5R 16S测序对肿瘤组织内的菌群进行检测，结果发现李斯特菌仅出现在Lmo和Lmo@RBC组中，并且Lmo@RBC的菌群多样性明显上升。进一步实验证实，借助转录组和5R 16S测序首次发现Lmo@RBC可诱导广泛的Gasdmermin依赖性细胞焦亡，从而逆转免疫抑制性肿瘤微环境并促进全身性的抗肿瘤免疫反应，对实体瘤和肿瘤转移有极好的治疗效果。
发表期刊：Oxid Med Cell Longev
影响因子：7.31
发表时间：2022.11
研究方法：5R 16S测序，代谢组
样本类型：肺组织
研究目的：通过微生物组与代谢组分析青衣汤对重症急性胰腺炎相关急性肺损伤的作用机制
重症急性胰腺炎（SAP）相关急性肺损伤（ALI）是一种间接的继发性肺损伤，作者首先通过以前的蛋白质组数据筛选ALDH2、AnxA1和ICAM-1被确定在肺损伤后发生SAP的发病机制中发挥重要作用，是青衣汤对抗SAP相关ALI的潜在核心靶点。接着，作者利用代谢组学和5R 16S测序鉴定实验组和对照组肺组织中的差异代谢物和微生物，通过相关性分析探讨核心靶点、信号通路、代谢表型和微生物菌群之间的关系，筛选出青衣汤对抗SAP相关肺ALI的潜在分子网络。在机制上，青衣汤可能通过促进ALDH2的表达来抑制铁下垂，并通过阻断完整的AnxA1的切割和下调ICAM-1的表达来抑制中性粒细胞的浸润。SAP引起大鼠肺炎症损伤，青衣汤能有效减轻SAP大鼠的肺损伤，改善了SAP大鼠肺组织微生物群的丰度及肺部呼吸功能，显著降低血清炎症因子水平。本研究整合网络药理学、代谢组学和5R 16s rDNA测序，揭示青衣汤抗SAP相关ALI的机制。
发表期刊：Front Microbiol
影响因子：5.15
发表时间：2023.01
研究方法：5R 16S测序，代谢组
样本类型：子宫内膜组织
研究目的：探究子宫内膜中微生物之间的相互作用及其对子宫腺肌症的影响
本研究通过对21例有子宫腺肌症和17例无子宫腺肌症的妇女子宫内膜样本进行5R 16S测序，以表征子宫内膜微生物群落的组成及其在子宫腺肌症中的潜在功能。结果发现子宫腺肌症患者的微生物群谱与无子宫腺肌症患者的对照组不同，并且确定了玉米乳杆菌（Lactobacillus zeae）、弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）、铜普氏菌（Prevotella copri）和洋葱伯克霍尔德氏菌（Burkholderia cepacia）等是子宫腺肌症的潜在生物标志物。Citrobacter freundii、Prevotella copri和Burkholderia cepacia对子宫腺肌症的诊断价值最为显著。PICRUSt分析显示在子宫腺肌症中糖酵解/糖异生、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路均上调。子宫腺肌症患者子宫内膜微生物群的改变对于决定子宫腺肌症的发生、进展、早期诊断和治疗具有潜在的应用价值。
参考文献
1、Qi Lin ; Hua Duan ;Sha Wang ;Zhengchen Guo ;Endometrial microbiota in women with and without adenomyosis: A pilot study.Front Microbiol,10.3389/fmicb.2023.1075900.
2、Yao Liu; Yiping Lu;Bo Ning;Xiaomin Su;Intravenous Delivery of Living Listeria monocytogenes Elicits Gasdmermin-Dependent Tumor Pyroptosis and Motivates Anti-Tumor Immune Response.ACS Nano,10.1021/acsnano.1c09818.
3、Peng Ge ;Yalan Luo ; Qi Yang;Haiyun Wen;Ferroptosis in Rat Lung Tissue during Severe Acute Pancreatitis-Associated Acute Lung Injury: Protection of Qingyi Decoction.Oxid Med Cell Longev,10.1155/2023/5827613.
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