蛋白组学·2018文献阅读大赛 | 非变性质谱结合酶解技术揭开生物制药的糖形异质性

“蛋白组学·2018”线上文献阅读大赛开赛以来，陆续收到了很多参赛作品。经过评审团队精心的审阅、筛选后，精选出6篇优秀参赛作品，参赛作品将陆续在“精准医学与蛋白组学”学术平台发布。

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参赛者：王悦 老师，同济大学。

参赛作品：Nat. Commun. | 非变性质谱结合酶解技术揭开生物制药的糖形异质性

编者按：生物制药的批准需要对药物分子进行深度解析，包括药物蛋白分子的氨基酸序列和完整的翻译后修饰信息。例如蛋白的糖基化修饰就可能影响药物的效率和安全性。

2018年，Therese Wohlschlager等人在国际著名期刊Nature Communications上发表其研究成果，研究者采用非变性高分辨质谱结合一系列蛋白酶与糖苷酶，解开治疗性融合药物蛋白依那西普（Etanercept）的糖形异质性，这项技术可以应用于生物制造工艺。

文献解读

1. 整体水平上对依那西普的非变性质谱分析

首先，研究者利用Thermo Scientific Exactive Plus EMR高分辨质谱仪评估对依那西普进行整体分析的可行性。对依那西普进行纳升级电喷雾直接进样分析得到整体蛋白分子26+~20+的价态分布（图1b）。每一种价态都包含多种不同的蛋白变体，包括不同的糖基化修饰，比如24+（图1c）分布，去卷积后得到至少70个清晰的蛋白信号。把依那西普氨基酸序列的理论平均质量102,160 Da作为基准，计算出糖基化修饰的质量为约23,000~29,000 Da。

为了减少样本的复杂性和分子大小，研究者采用不同酶解法来实现（图1a）：（i）利用唾液酸酶去唾液酸化（图1d），（ii）利用PNGase F酶去N-糖基化（图1f），（iii）利用唾液酸酶+PNGase F酶结合（图1h），（iv）利用唾液酸酶+O-糖苷酶结合，（v）利用IdeS酶解开TNFR与Fc域，（vi）利用蛋白酶trypsin或AspN得到糖肽。

 图1 依那西普的分子结构和非变性质谱分析

2. 去掉N-糖基化来确定O-糖形

利用唾液酸酶+PNGase F酶结合分别去除唾液酸和N-糖基化修饰后，依那西普上只留下O-糖基化修饰（图1h）。去卷积后的图谱中强度最高的几个峰中质量差均为365.1 Da， 表示一个hexose (Hex)和一个N-acetylhexosamine (HexNAc)组成的core 1 O-糖结构（图2a标注14-23）。与唾液酸酶+PNGase F酶结合法相比，仅用PNGase F酶处理依那西普因为保留了O-糖的唾液酸化而表现出更高的复杂性，同一个core结构中不同信号峰之间的差异为291.3 Da（图2b）。

图2 依那西普O-糖形的注释

3. TNFR与Fc域的N-糖基化鉴定

由于N-糖基化的多分支结构比O-糖基化复杂许多，研究者利用IdeS酶解开依那西普的TNFR与Fc域并用亲和提纯法分别进行分析（图1a），这种做法减少了N-糖形的复杂度。研究者再利用利用唾液酸酶+O-糖苷酶结合，剩下的峰主要为去唾液酸化的N-糖（图3a，b）。为了获得N-糖的精确结构，研究者利用AspN/trypsin酶解依那西普等到糖肽，并根据糖肽的数据库得到N-糖结构。

 图3 依那西普TNFR与Fc域的N-糖基化

4. 整体蛋白水平整合糖基化数据

整合上述方法的结果，依那西普主要有6种N-糖基化的组合以及3种O-糖基化的组合（图4a，b），包括TNFR域的2 × A2G2和2 × A2G2F型N-糖，Fc域的A2G0F或A2G1F型N-糖，以及18，19和20三种O-糖型。

 图4 依那西普去唾液酸化后的N-和O-糖基化

结语

本文利用非变性高分辨质谱结合一系列蛋白酶与糖苷酶这一技术，提供了鉴定高糖形药物蛋白的方法。提供糖形异质性的综合信息，少量样品制备的快速分析和建立产品特征的指纹图谱使该方法能够有效地用于生物制药的质量控制。

参考文献：

Therese Wohlschlager, et al. (2018). Native mass spectrometry combined with enzymatic dissection unravels glycoform heterogeneity of biopharmaceuticals. Nat. Commun.

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