BioArt深度快讯丨华东师大李大力组等首次在小鼠和斑马鱼中实现可稳定遗传的遗传密码子扩充——附独家专访和点评
BioArt按：12月9日，Cell Research在线发表了来自华东师范大学上海市调控生物学重点实验室与巴黎第六大学巴黎索邦生物研究所、加州大学旧金山分校药学院、法兰西公学院生物跨学科研究中心、悉尼大学医学院、华东师范大学脑功能基因组学研究所和巴黎高等师范学院生物系等多家国内外单位合作的题为“Heritable expansion of the genetic code in mouse and zebrafish”最新研究成果，这项研究主要是利用转基因技术等手段在世界上首次构建了具备遗传密码子扩充能力的转基因小鼠和斑马鱼。该文通讯作者分别是华东师范大学上海市调控生物学重点实验室李大力博士、加州大学旧金山分校药学院王磊博士和巴黎第六大学巴黎索邦生物研究所叶世欣博士，华东师范大学生命科学学院2014级博士研究生陈宇庭为论文第一作者，华东师范大学为论文第一作者单位。
论文详解：
生物体内编码20种天然氨基酸的三联体密码子通常是64个，其中含3个终止密码（UAA,UAG,UGA）一般只作为终止信号，不编码氨基酸。但是人们发现在极少数古生菌和真菌中能利用终止密码子，将硒代半胱氨酸或吡咯赖氨酸等稀有氨基酸整合到蛋白质中，这种情况也被认为是遗传密码子的天然扩充。科学家们希望利用这一现象来建立操控蛋白质的技术手段，这样能更精准、更灵活地在离体和体内探究蛋白质结构与功能的关系、翻译后修饰对蛋白质生理功能的影响，甚至精确调控蛋白质活性。通过多年的努力，科学家们最终采用各种化学与合成生物学的手段，将具有特殊官能团的非天然氨基酸(Unnatural amino acids, Uaa)引入到蛋白质中。这些新的蛋白质某些氨基酸残基带有与天然氨基酸所不同的全新官能团，赋予它们新的物理化学性质、生物学特性或药理学性质。
为了使Uaa能够像天然氨基酸一样特异地整合到多肽链上，本论文通讯作者之一的王磊博士（博后期间在Peter Schultz教授实验室）2001年首次建立了通过扩充大肠杆菌遗传密码子来实现非天然氨基酸定点整合的方法，该成果被发表在当年的Science杂志上（见下图）。
这种方法是将编码Uaa所需的特定翻译元件引入到大肠杆菌，使其具备利用非天然氨基酸编码蛋白质的能力。如图1所示，简单而言包括仅能识别非天然氨基酸的tRNA（orthogonal tRNA）与氨酰tRNA合成酶(orthogonal synthetase)的正交体系，以及不与编码氨基酸的內源密码子竞争而又能被新的tRNA所识别、解码的“特殊密码子”（unique codon）（图1）。
图1 （来自2009，Qian Wang et al, Chemistry & Biology）
在这个正交体系中，用到的“特殊密码子”一般是琥珀终止密码子UAG。 经过十多年的发展，现在已经构建了非常多的Uaa/tRNACUA/氨酰tRNA合成酶（aaRS）正交体系，而这种利用终止密码子（主要是UAG）编码Uaa的方法，被称为遗传密码子扩充。该正交系统都是由基因编码，具备运用到所有的可进行遗传操作的生物体的潜力。目前该技术除了广泛应用于体外培养的细胞之中，在拟南芥、非脊椎动物如线虫，果蝇等物种中都证明其具备稳定遗传能力，得到了很好的拓展与应用。但是能否在脊椎动物中构建可稳定遗传的tRNACUA/aaRS正交体系，实现遗传密码子扩充仍然未知。在脊椎动物中的尝试不仅仅是技术上的应用拓展，更为重要的是这是对自然产生的遗传密码的改变，在进化上更加高等的脊椎动物是否允许密码子扩充，能否维持和稳定传递？这些都是非常关键的重要遗传学问题。这篇文章率先报道通过遗传操作方法构建的tRNACUA/AzFRS转基因小鼠和斑马鱼具备遗传密码子扩充能力，而且这些动物没有表现出明显的缺陷，证明遗传密码子扩充可以在脊椎动物中稳定遗传将为生物学与医学研究提供非常有前景的新的技术体系和动物模型。
小鼠作为一种常用的哺乳动物模型，因其与人类具有高度基因同源性，被广泛应用于发育、生理和病理等研究。作者首先将能编码非天然氨基酸p-azido-phenylalanine (AzF)的tRNACUA/AzFRS正交对的表达质粒进行优化，并建立RS(tRNA)4×转基因小鼠品系。接着，作者通过Western Blot检测了转基因小鼠各组织AzFRS的表达水平，证明建系成功。通过对转基因小鼠的组织形态观察、肝组织RNAseq，血液生化指标检测，证明了将tRNACUA/AzFRS正交对基因表达元件引入到小鼠体内并未对其造成显著生理损伤。随后通过分离小鼠的原代细胞，如神经细胞、免疫细胞和成纤维细胞，利用慢病毒双荧光报告体系，检测到tRNACUA/AzFRS正交对在神经细胞和免疫细胞上能够实现终止密码子的通读，但在成纤维细胞中未发现通读。作者证明可能是由于tRNA 在成纤维细胞中表达受限制而导致通读不能被观察到。给转基因鼠饲喂含有非天然氨基酸AzF的水也没有发现动物血液生化指标的明显变化，证明小鼠中可以实现遗传密码子的扩充（见下图）。
为了能够在活动物中观察到遗传密码子扩充的现象，作者选择了斑马鱼作为研究对象。斑马鱼与哺乳动物具有许多保守的分子与细胞机制，是活体成像研究的重要模式动物。利用Tol2 转座子技术将优化后的tRNACUA/aaRS 正交对基因表达元件引入到斑马鱼基因组，构建了可稳定遗传的RS(tRNA)4×转基因斑马鱼。在转基因斑马鱼的胚胎和成体组织中检测了AzFRS的表达，将该转基因斑马鱼直接饲养在含有AzF的水中，并未发现AzF对它们有毒性，接着作者利用双荧光报告质粒，在F2代以后的转基因斑马鱼活体内观察到终止密码子的通读，实现了斑马鱼的遗传密码子扩充（见下图）。
总之，这篇论文通过将tRNACUA/aaRS 正交对基因表达元件稳定整合到小鼠和斑马鱼基因组内，构建了可遗传的转基因小鼠和转基因斑马鱼率先在原理上证明脊椎动物遗传密码子扩增的可行性和遗传稳定性，说明遗传密码子在复杂生物中具有较高的延展性。非天然氨基酸可以携带多种官能团，具有特殊理化性质，将来有望实现复杂动物体内的蛋白质分子标记、模拟翻译后修饰、光控激活特定蛋白质分子等精确操控，成为体内精细、可控的研究蛋白质功能的新手段。 当然，从目前结果来看，脊椎动物体内扩充遗传密码子的效率比在单细胞中低，进一步的技术优化将提高Uaa的插入效率和扩充其应用。该课题组今后可以采用多种方法和手段，希望该课题组能实现哺乳动物遗传密码子的高效扩增，使其成为更为普适性的技术体系。
专家点评：
陈鹏（北京大学化学与分子工程学院教授，北大-清华生命科学联合中心PI，中组部青年拔尖人才，国家“杰青”）
华东师大李大力、美国UCSF王磊、法国巴黎第六大学叶世欣等研究人员的该项工作，首次在小鼠和斑马鱼中实现了可稳定遗传的遗传密码子扩充技术（genetic code expansion）。可以说，该工作是在脊椎动物中应用遗传密码子扩充技术的开创性工作。通过几天前北大药学院周德敏教授发表在Science杂志的基于该技术的病毒疫苗一文（详见此前BioArt的深度报道《BioArt深度解读丨Science报道北大周德敏课题组在病毒疫苗领域的重大突破——附特别点评》），遗传密码子扩充技术在生命科学基础研究及生物医药领域的价值可见一斑。
如今，该技术的常规应用大多数还是在大肠杆菌（原核生物）和酵母、哺乳动物细胞（真核生物）等体系中。由于基因操作的便利，研究者们可通过常规的转染或转化方法实现非天然氨基酸在这些体系中的定点引入。然而，将遗传密码子扩充技术拓展到高等生物中则面临许多挑战。迄今为止，虽然研究者们已将该技术应用到了诸如线虫、果蝇、拟南芥等多细胞体系以及致病菌、病毒等多种病原体当中，但在高等模式生物中的使用还相当困难。
目前来看，在高等动物中引入遗传密码子扩充技术有两个思路，一是从成体动物入手，一个从胚胎入手。这两个方向的努力都在最近获得了突破。今年8月，英国剑桥大学和MRC分子生物学实验室的Jason Chin团队在Nature Chemical Biology杂志上发表论文（见下图），报道了他们在活体小鼠大脑中实现遗传密码子扩充技术的工作。该论文利用腺病毒转染体系，在小鼠脑部引入了tRNA及氨酰tRNA合成酶，成功地在活体小鼠脑部实现了非天然氨基酸的定点引入。该体系不是一个稳定遗传的系统，也不能在全身均一表达，同时其转染所使用的病毒采用颅内注射的方法引入成年活体小鼠当中，而非天然氨基酸则通过脑内灌注给药，在操作上较为复杂。
而此次李大力等人发表工作的重要性，一方面在于其将该翻译体系引入了高等动物当中，更重要的一方面，在于其具有可稳定遗传的特性。他们采用从胚胎入手的思路，直接向小鼠的合子中转入编码tRNA及氨酰tRNA合成酶的基因，经过胚胎、幼崽阶段，筛选出成功引入遗传密码子扩充体系的成体小鼠。这些小鼠通过杂交，可在后代中稳定维持一定比例的表达有遗传密码子扩充体系的转基因小鼠。文中一系列数据显示，该转基因小鼠的代谢与正常小鼠没有区别，而在各个组织中，均显示出一定程度的氨酰tRNA合成酶的表达，在分离出的原代细胞中可进行非天然氨基酸的定点引入。从这点上来说，该工作明确展现了遗传密码子扩充技术在脊椎动物中引入、维持、遗传的能力。综上，该工作提供了基于遗传密码子扩充技术的宝贵的可传代模式动物，显著提高了利用该技术在高等动物中进行深度探索的可行性。
当然，在高等动物中实现非天然氨基酸的高效表达还有许多需要优化的方面，该文章是一个开创性的源头。例如，本文中也提到，该策略得到的转基因小鼠，其遗传密码子扩充元件的表达量具有组织特异性，在一些组织或细胞中因表达量低而无法被检测到。另外，非天然氨基酸在活体小鼠内直接给药和表达的可操作性，也是迫切需要优化的问题。随着这些挑战性问题的逐渐解决，有望在不远的将来真正实现非天然氨基酸向活体动物的可控、特异、定点引入，为在活体动物中的蛋白质化学生物学研究奠定基础！
李大力老师接受BioArt独家专访：
BioArt：请问大力老师最初做这个课题的idea来自哪里？或者说是什么原因驱使您做这样一个看起来跟您目前课题组的主要研究方向似乎关联不大的课题？
李大力：2013年我们建立了小鼠和大鼠的基因编辑技术体系以后，促使我对一些遗传学新技术比较感兴趣，希望能在哺乳动物模型中建立新的技术体系，提高技术的适用性。而让我接触到遗传密码子扩充这一技术比较偶然，主要得益于我们华东师范大学与法国高师集团联合培养研究生项目。2014年春节前，在我留法学生的联系下认识了本论文通讯作者之一的叶世欣老师。她春节回国探亲期间我们见面交流了一下各自的研究方向。世欣利用非天然氨基酸标记技术做出了非常重要的成果。这项技术令我耳目一新也激起了我的兴趣，特别是了解到当时还只是在线虫和果蝇等低等动物中实现了可遗传的密码子扩充后更加让我觉得是一个很好的机会。因为这不仅仅是一个技术问题，更重要的是遗传学的一个基本问题：高等动物中能否耐受遗传密码子的扩增，密码子扩增后给生物体带来的后果是什么？当然，我也希望能在哺乳动物中建立新技术，开展新的基础和应用研究。当时我就提出跟世欣合作，过完年拿到质粒立即开始了相关工作。在转基因小鼠构建成功后，我们又与王磊老师取得了联系，他对这一课题合作非常感兴趣。后续在转基因小鼠的功能性验证和论文写作方面王磊老师都给予了极大的帮助。
BioArt：您这篇文章运用的技术和不久前北大周德敏教授发表的Science文章（详见BioArt此前的深度报道《BioArt深度解读丨Science报道北大周德敏课题组在病毒疫苗领域的重大突破——附特别点评》）中用的技术类似，他们把这个技术用于改变现有的病毒疫苗制备技术，那么您的这项研究将来有哪些应用前景？
李大力：我们所使用的技术与周老师在science上发表的工作是非常类似的，只是具体使用的非天然氨基酸和氨酰tRNA合成酶/tRNA正交对不一样。当然，周老师的工作是非常震撼的，其意义和应用价值远大于我们的工作，可以把该技术的应用带上了一个新的台阶。我们的工作的意义主要还是在基础研究方面，证明脊椎动物可以稳定遗传扩充的密码子而且没有带来明显的不良作用。这为将来在高等动物模型中实现蛋白质的标记、蛋白质翻译后修饰的功能研究以及蛋白质活性的精确调控等方面提供新的解决方案。最想做的是利用光感应的非天然氨基酸在动物体内实现光遗传学方法精确控制蛋白质活性。当然，暂时而言我们这个体系效率还比较低，这影响了它的适用性。我们后期还在不断改进，希望能有更高的通读效率，实现更多应用。
BioArt：我们注意到此前这个系统在线虫和果蝇中已经建立了稳定的遗传系统，那么为何在斑马鱼和哺乳动物里面却迟迟没有建立起来，您的这个工作前后大概花费多少时间去完成？
李大力：我对这个领域的发展也不是特别了解，据我所知还是有几个课题组在开展类似的工作，只是我不大清楚他们工作进行到哪一步了。至于为何没有其他课题组发表，我不清楚。当然，要是有人发表了我们就很可能不会开展相关课题了。我猜测可能有几个方面的原因：在这个领域的几个主要贡献者多数都是化学背景，主攻方法学研究，对于高等模式动物系统不是太熟悉，没有特别花精力去运用陌生的系统来拓展这一方法的应用。另外，也有可能是做了但是没有成功。其实这个课题远比我之前设想的要复杂，因为这么多年来不单是没有构建稳定遗传的脊椎动物系统，连稳定表达这一系统的细胞系都是Jason Chin在去年才利用转座子系统建成。其实当时我也在用转座子建stable cell line，但是没有Jason动作快。我们的小鼠中也发现氨酰tRNA合成酶的表达是没有问题，关键是tRNA是否能工作。我们开始检测了MEF细胞，并没有发现有明显的通读。但是我们并没有放弃，而是考虑到tRNA表达可能不同组织之间有差异，所以选择了神经细胞和骨髓间充质干细胞，恰恰是在这两种细胞里面发现了明显的通读。所以原因可能是我们的小鼠中转基因插入的位点比较特殊，外源基因表达相对比较好，而且我们选择了多种原代细胞进行测试。我们转基因小鼠中的工作一共用了两年半的时间完成，而斑马鱼的工作主要是法国的课题组完成的。
BioArt：最后问一个比较confidential的问题，就是您这个工作有着怎样的投稿经历，希望您给圈内的读者朋友分享一下，或者说为何最终选择了Cell Research这本杂志发表。
李大力：坦诚的说在投稿cell research之前我们也尝试过两个杂志。后来我们了解到可能会面临非常强的竞争，所以希望能够比较顺利的把论文尽快发表，毕竟能够让读者尽快看到我们的论文是最重要的。经过多次讨论，大家最终一致认为Cell Research是最好的选择，不仅仅是因为近几年在国际上影响力已经非常大了，声誉很好，论文质量高，更重要的是跟编辑沟通可能会更加顺畅。所以我先跟杂志沟通并很快投稿。一审回来之后，3个评审的意见都非常positive，当然也提了一些领域里面非常感兴趣但也很难在技术上实现的问题。其中有评审也说“it would be understandable if the authors argue that such experiments are beyond the scope of the current report”“While not essential for this study”。所以我们又主动跟编辑沟通，补充了技术上可行的一些重要实验，论文也很快被接受了，可以说这次投稿是一次非常愉快的经历。
附论文评审人给出的高度评价：
“The work represents a significant technical achievement and will be a major step forward as a tool system to study a variety of biological processes in living model vertebrate organisms, both ex vivo and in vivo.”
“The studies have been well-performed and the findings are very convincing.”
附：论文主要作者简介：
李大力研究员，2001年毕业于湖南师范大学获学士学位，2004-2007年在美国德州农工大学开展联合研究，2007年获湖南师范大学遗传学博士学位，同年受聘于华东师范大学生命科学学院从事教学与科研工作, 先后破格晋升为副教授、研究员。研究方向主要关注基因编辑等遗传操作新技术的研发与应用。在国际上率先利用CRISPR/Cas9技术构建基因修饰大鼠的技术体系，实现大鼠多基因敲除，极大地提高了基因修饰动物构建效率；利用基因编辑技术通过定点修复凝血因子9基因的突变成功地在成年小鼠模型中治愈B型血友病。近年来以通讯作者身份在国际知名生物学期刊Nature Biotechnology, Nature Protocols，Cell Research, Nucleic Acids Research和EMBO Molecular Medicine等杂志上发表研究论文20余篇，申请基因编辑相关发明专利三项，其中一项已获授权。2016年12月，李大力老师入围长江学者青年项目（公示名单）。
Lei Wang is an associate professor (tenured ladder-rank faculty) at UCSF. He received BS and MS from Peking University mentored by Zhongfan Liu, and PhD from UC Berkeley mentored by Peter G. Schultz. His graduate research resulted in the first expansion of the genetic code to include unnatural amino acids (Uaas) in 2001, for which he was awarded the Young Scientist Award by the journal Science. After postdoctoral training with Roger Y. Tsien, Wang started his group at the Salk Institute in 2005, and moved to UCSF in 2014. Wang’s group has developed new methods for the expansion of the genetic code in a variety of cells and model organisms, including mammalian cells, stem cells, C. elegans, and recently embryonic mouse. His group discovered that release factor one (RF1) is nonessential in E. coli, and engineered autonomous bacteria capable of incorporating Uaas at multiple sites with high efficiency. By developing the concept of proximity-enabled bioreactivity, Wang’s group designed and demonstrated that a new class of Uaas, the bioreactive Uaas, can be genetically encoded in live systems. These bioreactive Uaas enable novel covalent bonding abilities to be specifically introduced into proteins and biosystems, opening the door for new protein engineering and biological research in vivo. Wang is a 2006 Beckman Young Investigator, a 2006 Searle Scholar, and a 2008 National Institutes of Health Director’s New Innovator Award recipient. Wang lab website: https://pharm.ucsf.edu/wang（王磊博士授权发布英文版简介）
叶世欣，Lehmann, 法国国家健康与医学研究院终身研究员，课题组组长，1998年本科毕业于北京大学化学系获得学士学位，2004年获得宾夕法尼亚大学博士学位，2004-2009年在洛克菲勒大学从事博士后研究，2010-2011在巴黎高等师范学院做博士后研究工作，2011年获得法国国家健康与医学研究院终身研究员，继续受聘于巴黎高等师范学院，2015年受聘于巴黎第六大学巴黎索邦生物研究所计算和定量生物学实验室(UMR 7238 CNRS)并担任课题组组长。研究方向主要是1) To apply methods associated with the genetic code expansion to understand the structure-function relationship of proteins. 2) To investigate the possibility of building basic functional proteins with a minimal set of amino acid repertoire.近年来，以第一作者或者通讯作者在Nature，Nature Chemical Biology，PNAS等国际著名杂志上发表多篇重要研究论文。其中2010年利用光谱学方法研究视紫红质受体构象变化，被2011年诺贝尔化学奖获得者Brian Kobilka称为“是不断启发与推动其他课题组在肾上腺素能受体（beta-adrenergic receptor)的研究”。
陈宇庭，论文第一作者，华东师范大学生命科学学院2014级博士研究生，该同学获得了华东师大研究生出国（境）短期研修项目与计算和定量生物学实验室共同资助，目前正在巴黎第六大学巴黎索邦生物研究所计算和定量生物学实验室学习。
（致谢：感谢陈宇庭同学对本文的贡献，感谢李大力老师在百忙之中接受BioArt专访，感谢北大陈鹏教授的精彩点评！）
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