BSA项目常见问题汇总
近半年来，小编苦受BSA各种锤炼与敲打，曾想当年有人和我说BSA，自己却是一脸茫然，对于自尊心强的我，备受打击。当即立下“雄关漫道真如铁，而今迈步从头越”的豪言壮志。如今，也算是功夫不负有心人，能在BSA方面略谈一二，今天给各位分享一下BSA项目后续的常见问题，以期共同进步。
BSA的全称bulked segregant analysis,中文名叫集群分离分析法,是指利用目标性状的一对亲本杂交，在其分离后代群体中 ，根据个体表型（或基因型）的极端差异，选取一定量两组表型差异极端的个体，将其DNA混合，构建两个基因池(pool)，结合高通量测序技术对混合样本测序,检测SNP，筛选与目的性状紧密连锁的分子标记和精细定位区域。BSA通过筛选目标极端性状，利用高效率低成本的混池测序技术，有效寻找与目标性状相关联的候选基因区域，是目前高效、低时耗、低成本的基因初定位方法。
目前混池测序根据不同的样品收集、样品处理方式、物种研究进展及项目经费等问题考虑可分为DNA-BSA、BSR、MutMap、简化BSA（BSA-SLAF）等。
BSA方法虽然好，听起来也简单方便，但是还有很多关键点需要我们实际操作时注意，那么究竟是那些呢？下面小编就以BSA-DNA为例将其常见的问题做一个简单的汇总，欢迎各位看官围观讨论~~
一
群体构建
重测序BSA适合有参考基因组的物种，适用于性状存在显著差异的双亲构建的性状分离的群体，永久性分离群体优于暂时性分离群体。
二
双亲来源
什么样的亲本适合构建群体？
尽可能选择性状差异单一，杂合位点少的亲本，同时亲本间差异不要过大，若亲本差异过大，会由于亲本间物种的差异而导致较重的假阳性，并易定位到假阳性区域；相反的也不能选择存在直接亲缘关系的两个品种，亲本差异过小，会容易定位不到候选区域；
三
混池构建及大小
如何构建混池？混池规模多大能够满足要求？
通过表型调查，筛选具有极端表型的个体构建两个混池，质量性状(1：2：1)具有主效位点的数量性状（正态分布）。表型统计不准确，或由多个微效基因控制，会影响定位效果。混池个体性状不极端，存在较多中间型，同样会导致定位结果不佳。
一般选择群体的5%到10%个体构建极端混池，建议极端样品在30+30以上。通常在样本量等情况允许的条件下越大越好，能够更进一步的缩小候选区域。具体需根据物种、样本情况等设计方案。在以往的项目经验中也会有个别项目由于特殊原因，混池规模无法达到30个，甚至只有十几个，那么还能做吗？在无法增加混池个体数时可以尝试。那么紧随而来的另一问题是“两个混池可用于测序的个体数不一样是否可以？”，为了保持两个混池间的一致条件，最好能够使混池间样品数保持一致，特殊情况下相差不大也可。
四
组织样采集及DNA提取
采样和提取需要注意哪些问题？
尽量取幼嫩组织，无病菌、虫卵及病斑。如采样后无法立即提取DNA，建议将组织经液氮速冻2-3h后转于-80℃冰箱保存，并避免反复冻融；子代混池样品如需进行混样研磨提取，为了保证子代能够等量混合，需在采样的新鲜组织进行取定量（打孔或称重），然后再速冻保存。
提取的基因组DNA除了要保证测序要求的浓度、体积等要求，还要尽量的降低杂质污染，控制降解程度，重测序对DNA的要求需控制在无明显杂质污染，主带清晰，无降解或轻微降解。杂质会影响测序时酶的反应，降解会影响测序的均匀性等。
五
测序策略
只有一个混池能做吗？
重测序BSA建议最好测两个亲本加两个混池，以便SNP过滤，减少假阳性。亲本测序深度推荐20×，子代混池达到每个混池个体平均测到1×。当然，不同群体类型对于测序样本要求也不尽相同。
六
分析策略
能够分析SV和CNV吗？
* SNP-index法（必须有2个亲本）：计算混池间的基因型频率差异。
SNP-index= ρ（隐性）/(ρ（显性）+ρ（隐性）)
ΔSNP-index= SNP-index（隐性池）- SNP-index（显性池）
*欧氏距离（ED）法：计算两混池间的欧氏距离，距离越大，差异越大。
*候选区域内功能基因注释：通过注释筛选候选基因。
NR、Swiss-Prot、GO、KEGG、COG
通过SNP-index和ED算法分别定位出关联区域，并取交集以进一步缩小定位区域。结合候选区域内基因注释结果，初步筛出与性状相关的基因，并针对基因上的SNP位点进行优先验证。也可以结合已有的SSR、基因克隆等工作缩小区域。
如需分析SV和CNV需要加大测序的数据量，SV要大于40×，CNV需达50×以上。
七
功能验证
常用有哪些验证方法？
Ø 将筛选到的候选SNPs转化为CAPS、dCAPS或KASP标记验证；
Ø 针对候选SNP设计引物，PCR扩增，扩增序列一代测序；
Ø RT-PCR验证候选基因表达变化……
想说
以上便是小编对BSA常见问题的几点整理，希望能够帮助将要、正在或快做完项目的您。如果各位看官有其它见解或建议，欢迎留言讨论。
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