免疫治疗丨免疫检查点抑制剂生物标志物之TMB
随着肿瘤免疫治疗时代的到来，免疫检查点抑制剂的研发和审批的进步，确保了免疫检查点抑制剂已经作为肿瘤治疗的新的有效方法之一。临床研究显示，单独使用PD-1抑制剂，只有20-40%的病人会对免疫治疗产生反应，医生很难知道免疫疗法是否对某个病人有效，如何筛选出这部分有应答的患者则是临床所面临及需要解决的问题 。（经典型霍奇金淋巴瘤是一个例外，单独使用，有效率高达80%以上）
有没有生物标志物（Biomarker）能够预测对免疫检查点抑制剂的反应？开发生物标志物对于帮助患者分层以及预估患者是否对免疫阻断单独疗法有反应，是否需要组合疗法或者接受其他的治疗是必要的。
精准医学始于靶向治疗，免疫治疗从一开始就在思考能否利用靶向治疗开辟新的成功路径。就目前而言，免疫治疗已经开辟了通向精准治疗的各种路径。
目前，影响 Immune checkpoint inhibitor（免疫检查点抑制剂）的有效生物标志物包括：PD-L1，MSI，dMMR，TMB，Neoantigen等，更多反映免疫疗效的生物标志物还在不断的研究与试验中。
今天我们聊聊TMB，TMB是目前免疫检查点抑制剂比较成熟的生物标志物之一。一直以来，学术界都认为直接测定肿瘤组织中的突变数量，也就是所谓的肿瘤突变负荷（TMB），是可以预测PD-1抑制剂等免疫治疗的疗效的。
肿瘤突变负荷，英文全称Tumor Mutation Burden（TMB）或Tumor Mutation Load（TML），是一种可定量的生物标志物，用来反映肿瘤细胞中所含有的突变数目，通常用肿瘤细胞基因组编码区的每百万碱基突变数来衡量。至于突变类型主要指单核苷酸的变异（SNV）和小片段的插入/缺失（Indel），是同义突变还是非同义突变，这是根据具体的算法来的，并不是非同义突变才有用，同义突变就没用。
TMB的算法通常采用FMI和MSK两家的算法，毕竟都是有大数据的算法（一家10万人数据，一家1万人数据），两家的算法差异较大，至于哪个更准，并没有做过比对。
TMB的值受到多种因素的影响，包括各种诱变剂：紫外线对黑色素瘤的影响，吸烟对肺癌的影响，错配修复蛋白功能缺陷（dMMR）以及由于POLE和POLD1基因编码的DNA聚合酶校正域中的突变和微卫星不稳定（MSI）等。
说到TMB，我们都知道是针对Tumor的突变数量进行一个统计与计算，这里面就涉及到两个重要的概念：Germline mutation（胚系突变）和Somatic mutation（体细胞突变）。
胚系突变（Germline mutation）来源于父母的遗传，先天就存在的，存在于所有的细胞中（来源于精子或卵子这些生殖细胞的突变，可以遗传，并且通常身上所有细胞都带有突变）；
体细胞突变（Somatic mutation）不是来源于父母的遗传，是后天发生的获得性突变，仅存在于肿瘤的细胞中（在诱变剂的影响下发生突变，即是在生长发育过程中或者环境因素影响下后天获得的突变）。
肿瘤的突变就称之为体细胞突变（Somatic mutation），是一种后天获得性的一种突变，常与肿瘤的发生与发展相关，所以计算TMB就是计算Somatic mutation，而不是计算Germline mutation。
TMB的定义主要来源于2013年 《Nature》上发表的两篇文章：肿瘤每Mb基因组序列中的体细胞突变积累数量，目前突变类型为碱基替换及小范围的缺失/插入。
下面，我们通过下图的轴线了解下TMB的来源：
1916年Ernest R Tyzzer最早提出肿瘤细胞是体细胞变异
70年代的探索发现肿瘤是一种“基因组疾病”，即基因突变是肿瘤产生的本质原因
肿瘤是由于基因突变导致的
1914年-20年期间，Hansemann及Theodor Boveri发现并提出染色质异常是导致肿瘤的主要原因
2009随着测序技术的不断提升，一代，二代，三代等技术的出现，针对肿瘤基因组的研究发现越来越多的肿瘤相关基因
2013肿瘤突变负荷出现（肿瘤细胞基因组中的突变的类型及数量）
1982年首次发现DNA碱基单点突变可导致癌基因的出现，引起正常细胞癌变。原癌基因（最早的ras基因）作为驱动基因导致肿瘤的发生
肿瘤的发生往往是体细胞基因突变积累到一定程度出现的细胞增殖失控
TMB最早的定义参考来源：
其中一篇是：Eric S. Lander和Gad Getz团队利用全外显子组测序和全基因组测序，分析了来自于27种肿瘤3083个样本（其中2957例是WES测序，126例是WGS测序），平均每个样本肿瘤突变负荷为4.0／Mb，呈现多样性分布。另外在同种癌症中，不同患者的肿瘤突变负荷也呈现多样性分布，比如在肺癌与黑色素瘤中，患者突变负荷从0.1-100／Mb均有分布。
另一篇是：Peter J. Campbell和Michael R. Stratton团队在分析30种肿瘤7042个样本的4,938,362个突变，发现肿瘤突变负荷从儿科癌症（0.001／Mb）到黑色素瘤(400／Mb)，呈多样性分布。并且同种癌症不同患者间突变负荷常常也是不同的（如果考虑到肿瘤异质性的话，同一个样本中不同肿瘤细胞中的突变负荷也可能不一样）。
现在行业内公认的TMB检测金标准就是WES测序（全外显子组测序技术），对≥30Mb的CDS区域（蛋白质编码区，外显子）序列中的突变数量进行统计分析与计算。经过近4-5年的发展，目前有越来越多的针对CGP（Comprehensive Genomic Profiling ，全面的基因组分析）的panel出来，并且被证实这些几百个基因的panel可以达到与WES的高度相关性，其中比较有名的就是2017年底被FDA批准的两个NGS大panel产品：FMI-F1CDX 与 MSK-IMPACT。
并不是所有的大panel都合适做TMB的！Panel选择的基因与肿瘤的关联性，基因的数量，包括检测的基因区域（热点/全外），Panel的CDS区域大小都是对TMB有着很重要的影响，一般建议panel的CDS区域要≥1.0Mb，当Panel的CDS区域≤0.5Mb的时候偏差会很大，是不推荐用于TMB检测的；此外，国际上很多公司都在模拟FMI报道的的10,000人TMB数据结果（F1与WES关联性达到R2 = 0.98），但是通过FMI的算法都没有办法拟合出来如此高的关联性，甚至怀疑大panel是无法取代WES检测的。（理性看待）
2017年11月FDA批准Foundation Medicine 旗下的FoundationOne CDx（F1CDx）大panel，用于泛癌症临床伴随诊断，其中还包括微卫星不稳定性（MSI）和肿瘤突变负荷（TMB）这两个重要的基因组特征，这预示着利用NGS方法检测肿瘤组织TMB被认可。
为什么TMB高，免疫治疗的响应率就高呢？
我们知道肿瘤免疫原性是启动肿瘤免疫的基础，所以能够产生新抗原的突变即为具有免疫原性的突变越多，肿瘤的免疫治疗就会越好。简言之，就是TMB的值越高，产生新抗原的可能性就越高，免疫应答率就会越高。
肿瘤突变包含同义突变和非同义突变，其中非同义突变会改变氨基酸编码序列，导致肿瘤细胞表达正常细胞所没有的异常蛋白。这些异常的蛋白如果能被活化的T细胞所识别，就称为“新抗原（neoantigen）”，能够产生新抗原的突变即为具有免疫原性的突变（immunogenic mutation）。
一般来说，TMB等于6.5的突变（FMI算法），相当于肿瘤基因组编码区含有100个非同义突变（100个同义突变），这些非同义突变中只有1%（范围0.07%~10%）可以产生与MHC高亲和力结合的突变肽段，能够与MHC高亲和力结合的肽段又只有50%能够被肿瘤患者体内的T细胞识别, 这些被能被T细胞识别的肽段中约有30%~40%可以被正常呈递到肿瘤细胞表面，能呈递到表面的肽段只有约30%能激发免疫反应。也就是100个非同义突变大约能产生1个有效的新抗原。TMB=6.5，最终可能也只产生1个新抗原。因此理论上TMB越高，最后能够被T细胞识别的新抗原产生也越多。
癌症免疫循环从癌细胞释放特异抗原开始
癌症免疫循环从癌细胞释放特异抗原开始，到杀死癌细胞结束主要分为7个步骤：1）肿瘤细胞死亡并释放肿瘤特异抗原；2）抗原呈递细胞摄取并处理肿瘤新抗原；3）抗原呈递细胞进入淋巴结激活T细胞；4）激活的T细胞离开淋巴结进入循环系统；5）T细胞穿过血管壁浸润到肿瘤微环境；6）T细胞通过特异性受体识别肿瘤细胞；7）肿瘤细胞被T细胞识别并溶解消灭。
到底什么样的病人容易TMB高，和哪些因素有关？
TMB的影响因素有很多，包括年龄的因素，成人（中位值3.6 mutations/Mb）比儿童（中位值1.7 mutations/Mb）的TMB就高。TMB的高低还与不同的癌肿有关。
此外，TMB的诱导因素也有很多，比如吸烟、日光照射、接触容易导致基因变异的有毒有害物质/放射性物质等。在分子层面，高度微卫星不稳定性（MSI-H）、DNA错配修复缺陷（dMMR）以及含有POLE和POLD1基因编码的DNA聚合酶校正域中的突变的病人往往TMB高。
2017年，《N Engl J Med》杂志上发表了一篇文章，绘制了多个实体瘤的中位肿瘤突变负荷值与PD-1抑制剂的客观缓解率之间的线性图。通过汇集各个文献数据，作者共搜集了27种肿瘤类型/亚型和其免疫治疗客观缓解率数据。（F1 的315基因panel计算各肿瘤的中位TMB值）。
27种肿瘤类型中PD-1/PD-L1抑制剂的客观缓解率与肿瘤突变负荷之间的相关性分析
2017年，《Mol Cancer Ther》杂志上的一篇研究证实：来自加利福尼亚圣地亚哥摩尔癌症中心的1638名癌症病人，使用FMI的315 panel，根据检测出的肿瘤突变负荷（TMB）高低分成3组：
低TMB（1-5个突变/Mb）
中TMB（6-19个突变/Mb）
高TMB（≥20个突变/Mb）。
其中50%的病人是低TMB，40%左右的病人是中间TMB，而仅有10%左右的癌症病人是高TMB。
TMB的检测目前主要是用组织样本，文献报道的也多数为FFPE样本。但是随着技术的发展，尤其是临床组织难以获取的情况下，用外周血的ctDNA样本也是可以的，但是二者之间的TMB-H cutoff 值还是不太一样。
目前还是组织为主，血液为辅，数据报道显示，组织TMB-H一般≥20，血液TMB-H一般≥16。
延伸：TMB与PD-L1与MSI的关系
2018年，MSK对240例接受PD-1抑制剂治疗的晚期肺癌患者的相关资料进行总结和分析时，发现PD-L1表达高低和TMB高低无关。
PD-L1表达量低的，TMB不一定低；TMB低的，可能PD-L1表达是高的。PD-L1表达量和TMB同时都高的患者，疗效最好，临床获益率为50%；两者都低的患者，使用PD-1抑制剂，临床获益率只有18.2%。TMB与PD-L1表达是两个独立的生物标志物。
NDB：no durable benefit ；DCB：durable clinical benefit
MSI是不稳定的MSI及dMMR是FDA批准的新靶点，MSI-H相应TMB也就高，但是高TMB的肿瘤并不一定会发生MSI。
MSI-H是TMB-H的子集，MSI-H的患者中，97%的患者TMB不小于10个突变/Mb，83%的患者不小于20个突变/Mb。但是，反过来，只有16%的TMB高的患者。
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