孙树汉最新的18分文章说了什么？

今天我们介绍的是二军大孙树汉教授最近的Nat Cell Biol文章：

The MBNL3 splicing factor promotes hepatocellular carcinoma by increasing PXN expression through the alternative splicing of lncRNA-PXN-AS1.Nat Cell Biol.2017 May 29. doi: 10.1038/ncb3538.

关于孙树汉教授，大家应该不陌生了，孙教授是国内做肝癌和lncRNA研究的大牛之一，我们之前也介绍过（lncRNA研究大神，看看你都认识谁？

我们先看看近几年孙树汉教授发表的10分以上的文章：

1.The MBNL3 splicing factor promotes hepatocellular carcinoma by increasing PXN expression through the alternative splicing of lncRNA-PXN-AS1，Nat Cell Biol. 2017 May 29. doi: 10.1038/ncb3538.

2.METTL14 suppresses the metastatic potential of hepatocellular carcinoma by modulating N6 -methyladenosine-dependent primary MicroRNA processing.Hepatology. 2017 Feb;65(2):529-543. doi: 10.1002/hep.28885

3.Systemic genome screening identifies the outcome associated focal loss of long noncoding RNA PRAL in hepatocellular carcinoma.Hepatology. 2016 Mar;63(3):850-63. doi: 10.1002/hep.28393.

4. Long noncoding RNA DANCR increases stemness features of hepatocellular carcinoma by derepression of CTNNB1.Hepatology. 2016 Feb;63(2):499-511. doi: 10.1002/hep.27893

5. Oncofetal long noncoding RNA PVT1 promotes proliferation and stem cell-like property of hepatocellular carcinoma cells by stabilizing NOP2.Hepatology. 2014 Oct;60(4):1278-90. doi: 10.1002/hep.27239

6. A long noncoding RNA activated by TGF-β promotes the invasion-metastasis cascade in hepatocellular carcinoma.Cancer Cell. 2014 May 12;25(5):666-81. doi: 10.1016/j.ccr.2014.03.010

7. Long noncoding RNAs associated with liver regeneration 1 accelerates hepatocyte proliferation during liver regeneration by activating Wnt/β-catenin signaling.Hepatology. 2013 Aug;58(2):739-51. doi: 10.1002/hep.26361

8.Repression of the long noncoding RNA-LET by histone deacetylase 3 contributes to hypoxia-mediated metastasis.Mol Cell. 2013 Mar 28;49(6):1083-96. doi: 10.1016/j.molcel.2013.01.010

9.Hepatitis B virus X protein (HBx)-related long noncoding RNA (lncRNA) down-regulated expression by HBx (Dreh) inhibits hepatocellular carcinoma metastasis by targeting the intermediate filament protein vimentin.Hepatology. 2013 May;57(5):1882-92. doi: 10.1002/hep.26195.

10.Long noncoding RNA associated with microvascular invasion in hepatocellular carcinoma promotes angiogenesis and serves as a predictor for hepatocellular carcinoma patients' poor recurrence-free survival after hepatectomy.Hepatology. 2012 Dec;56(6):2231-41. doi: 10.1002/hep.25895.

11.The histone deacetylase 4/SP1/microrna-200a regulatory network contributes to aberrant histone acetylation in hepatocellular carcinoma.Hepatology. 2011 Dec;54(6):2025-35. doi: 10.1002/hep.24606.

12.Long noncoding RNA high expression in hepatocellular carcinoma facilitates tumor growth through enhancer of zeste homolog 2 in humans.Hepatology. 2011 Nov;54(5):1679-89. doi: 10.1002/hep.24563

下面我们就来看文章的内容，文章主要围绕剪接因子MBNL3在肝癌中的功能和分子机制展开，内容可以分为MBNL3的临床意义、MBNL3的细胞和动物功能以及MBNL3的上下游分子机制三部分。

1. 临床部分

文章关键基因MBNL3的mRNA和蛋白在肝癌样本中高表达，并且与分化程度、AFP水平和肿瘤大小相关，KM生存分析显示MBNL3高表达预示差预后（RFS和OS），且作为独立的预后指标。

在这一部分用到了Oncomine数据库，组织芯片，相关性分析，KM生存分析和Cox回归，还把MBNL3的mRNA和蛋白区分研究，这一部分内容对应到我们“医学生做基础科研，发表1-3分文章的四个套路”的第一个套路——临床样本出发的研究（优惠来了：“做医学基础科研，发表1-3 分文章的四个套路” 40 节系列课上线啦！），其中Oncomine等工具也有介绍。

2. 细胞和动物部分

• 首先是MBNL3的过表达：选取两株细胞SMMC-7721和QSG-7701进行MBNL3的过表达；

• 然后是MBNL3的沉默：用2条shRNA以避免脱靶效应，选取SMMC-7721，MHCC97H, HCCLM3, HepG2 和Hep3B这5株细胞进行MBNL3的基因沉默；

• 表型的检测：细胞增殖和生长——CCK8，EdU染色和克隆形成，细胞凋亡——TUNEL和凋亡指标。

以上是细胞水平。

接下来是动物实验：

• 皮下成瘤：研究MBNL3对肝癌生长的影响；

• 脾内成瘤：研究MBNL3对肝癌细胞定植的影响。

与第一部分类似，分别对应课程的第二和第三个套路（细胞和动物），这里需要注意的是：对MBNL3进行了基因沉默和过表达；在沉默的时候选取了2条shRNA，进行多株细胞实验，兼顾外和体内功能。

以上的临床相关性和细胞、动物功能部分基本是套路，换句话说换个基因基本也可以按照这个套路来玩，到这一部分文章的分数大约在3-5分上下浮动。

3. 机制部分

这一部分是让这篇文章过10分的关键。前面的两部分工作是围绕文章关键分子MBNL3从临床意义、细胞和动物的体内外功能展开的，机制部分单独拿出来也能讲个故事。

首先我们把机制分为上游与下游两部分。

上游部分说的是干细胞特性相关的转录因子OCT4, SOX2 和NANOG对MBNL3的转录上调，用的方法是：结合位点预测加ChIP。

当然，按照转录因子对靶基因的调控方法我们还可以补充上：荧光素酶报告基因实验和EMSA。

上游机制部分比较简单，下游机制部分才是重点和难点，因为这里涉及到了几个关键词：lncRNA，可变剪接，miRNA对mRNA 3‘UTR的结合和降解，mRNA的翻译调控等。

我们先把结论理出来：

• lncRNA PXN-AS1有两个女儿，姐姐叫PXN-AS1-L（large），妹妹叫PXN-AS1-S（small），区别是姐姐L比妹妹S多了一段序列Exon 4，作为接生婆的MBNL3比较偏心姐姐L，所以姐姐PXN-AS1-L的表达量很高。

• 姐姐L和妹妹S的性格是完全不同的（姐姐是红皇后，妹妹是白皇后）：姐姐PXN-AS1-L由于多了一个Exon4序列，所以能与癌基因的PXN mRNA的3'UTR区结合，而这个3'UTR区正好是miRNA-24的结合位点，这样PXN-AS1-L与PXN mRNA的结合就导致miRNA-24对PXN mRNA的降解减少，这样就间接起到了保护PXN mRNA的作用，所以姐姐PXN-AS1-L发挥促进肝癌的功能，是名义上的“坏（红）皇后”。

• 妹妹PXN-AS1-S也能与PXN mRNA结合，与姐姐不同的是由于没有Exon4 的作用，妹妹PXN-AS1-S与PXN mRNA结合后导致PXN mRNA的蛋白翻译受阻，这样产生的PXN就少了，所以发挥的功能是抑癌基因，是名义上的“白（好）皇后”。

这一部分的研究比较复杂，占了整篇文章的2/3的篇幅，涉及到的方法有：RNA-seq后GO分析，GSEA分析，可变剪接AS事件分析，蛋白编码能力预测（txCdsPredict），RNA pulldown，RIP，RNase保护实验，荧光素酶报告基因实验，核糖体脱落实验（ribosome runoff assays ）等等研究lncRNA对靶基因调控的经典实验。

具体我们就不展开说明了，X师兄为大家准备了线下讲座，会从十个层面为大家介绍lncRNA的作用机制以及这些研究方法：

讲座时间地点：后天6月10号（周六）上午9点到12点，上海市华山医院综合楼4楼大会议室，欢迎大家前来捧场！

如果大家看不懂这篇文章在说啥，可以看相关文章补充背景知识：

可变剪接：

lncRNA与DNA和蛋白作用方法：

转录因子：

高分文章研究模式：

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