J Pineal Res：不能承受之“重”，周舟课题组揭示褪黑素通过调控SERPINA3N依赖性神经炎症拮抗TMT引起神经毒性

金属一直与我们的日常生活的每一部分息息相关，重金属亦是如此，人类利用重金属的初衷就是为了让它们造福人类，然而近些年重金属中毒事件频繁曝出：食物大米镉超标，水源污染血铅超标，化妆品中汞超标，甚至是重金属投毒砷化物中毒…
     一提到重金属，大家的反应大概是酱紫的。。。

重金属中毒几乎等于致命的损伤，三甲基氯化锡（ Trimethyltin Chloride, TMT）作为一种剧毒重金属化合物，广泛应用于塑料、油漆、农药、杀虫剂、灭菌剂等。对人体具有高度毒性，其能通过呼吸道、消化道及皮肤进入体内蓄积，半衰期长，造成毒性损伤，严重者甚至昏迷、死亡。

大量流行病学证据表明，TMT暴露是阿尔兹海默症等神经退行性疾病的高危因素之一，但是TMT神经毒性机制复杂，分子水平目前仍缺乏深入的研究。临床上TMT中毒的救治也无特效解毒剂，尚缺乏有效的救治方法和策略。褪黑素（melatonin）是由松果腺和其他器官合成，具有如调节昼夜节律，清除自由基和对抗炎症等多种生物学功能的生理性激素。melatonin是否可以通过调节神经炎症来拮抗TMT诱导的脑损伤尚未见研究报道。

2019年7月30日，《Journal of Pineal Research》（IF 15.211）在线发表了浙江大学公共卫生学院周舟课题组题为“Inhibition of SERPINA3N‐dependent neuroinflammation is essential for melatonin to ameliorate trimethyltin chloride- induced neurotoxicity”的最新研究工作[1]。他们首次报道褪黑素通过调控SERPINA3N-依赖性神经炎症拮抗TMT引起的神经毒性，为临床治疗重金属污染对公众健康造成的损害提供了新的视角。

结果

melatonin能有效逆转TMT急性暴露所造成的小鼠中枢神经系统损伤

首先，作者通过腹腔给药TMT，建立中枢神经系统损伤的小鼠模型，并通过癫痫发作等级评估发现TMT急性暴露导致小鼠癫痫发作评分显著升高（图1A），被动回避及新颖物体识别行为学范式发现TMT组小鼠的步入潜伏期明显缩短（图1B,C），新颖物体识别再认能力降低（图1D-F），提示了TMT急性暴露可引起中枢神经系统损伤。

随后，他们用melatonin（MEL）干预治疗，行为学实验发现小鼠癫痫发作评分显著降低，小鼠的步入潜伏期明显升高，物体识别记忆能力显著增强（与TMT组小鼠相比，图1），这提示了melatonin能有效逆转TMT急性暴露所造成的癫痫发作及学习记忆损伤。

图1 melatonin可改善TMT急性暴露引起异常神经行为损伤

进一步，作者用Nissl和HE染色观察小鼠海马组织病理学变化。结果发现，TMT急性暴露可导致小鼠海马区神经元结构受损及丢失，出现组织空化现象，而melatonin可显著改善TMT对海马组织的形态学损伤（图2）。

图2 melatonin有效改善TMT急性暴露所造成的小鼠大脑海马区神经元丢失

SERPIAN3N是melatonin拮抗TMT引起神经毒性的关键分子靶点

为了探讨melatonin的保护作用机制，作者应用定量蛋白组学技术分析发现丝氨酸蛋白酶抑制因子A类3（SERPIAN3N）在TMT急性处理小鼠海马组织中的表达升高，居于首位，而melatonin干预治疗则显著抑制这一现象（图3，表1）。

图3 定量蛋白质组学分析小鼠海马区差异蛋白

表1 TMT和melatonin导致小鼠海马内的蛋白变化

随后，为验证上述SERPINA3N的表达变化，作者用qPCR和Western blot分别检测了海马SERPINA3N mRNA和蛋白的表达水平。结果发现，TMT急性处理小鼠海马组织中SERPINA3N的mRNA含量和蛋白表达水平均升高，而melatonin干预可显著逆转这一现象（图4），与上述结果一致（表1）。这提示了SERPIAN3N是melatonin拮抗TMT引起神经毒性的关键分子靶点。

图4 melatonin抑制TMT诱导的SERPINA3N表达

melatonin有效改善TMT诱导的星形胶质细胞的增殖及促炎因子的释放

有研究表明，Serpina3n基因在活化的星形胶质细胞中高度表达[2]，基于此，他们作进一步研究。首先免疫荧光分析发现，TMT处理可显著提高海马DG和CA3区GFAP的表达，提示了TMT可诱导星形胶质细胞活化，导致星形胶质细胞增殖，而melatonin可抑制由TMT诱导的星形胶质细胞活化（图5A）。值得注意的是，TMT诱导星形胶质细胞增殖，其特征是激活海马星形胶质细胞中SERPINA3N和GFAP的表达同时增加，此外，melatonin干预治疗也同时抑制了TMT急性暴露小鼠海马中SERPINA3N和GFAP的表达（图5A，图6）。

图5 melatonin可抑制由TMT诱导的星形胶质细胞活化

图6 SERPINA3N特异性表达于海马区星形胶质细胞

进一步验证发现，TMT组小鼠海马组织中C3、Gbp2、Serping1、Ccl2、Cxcl10 mRNA表达量显著增加（图5B-G），这些指标也被证明是神经毒性星形胶质细胞活化的标志[3,4]，这些结果提示了SERPINA3N特异性表达于海马区星形胶质细胞。

活化的星形胶质细胞可产生促炎因子，参与神经炎症反应[5]，因此，他们接下来检测了TMT急性暴露小鼠海马区促炎因子的变化，以及melatonin干预情况。结果发现，TMT可导致TNF-α（肿瘤坏死因子），IL-6（白细胞介素-6）和IL-1β（白细胞介素1）的表达上调，melatonin可有效减轻TMT引起的小鼠海马区炎性因子与炎性相关趋化因子的释放（图7）。

图7 melatonin可有效减轻TMT引起的小鼠海马区神经炎症反应

 过表达SERPINA3N可阻断melatonin对TMT引起神经毒性和神经炎症的保护作用

基于上述结果，作者构建了载有Serpina3n的腺相关病毒AAV-CMV-Serpina3n-2A-mScarlet-3FLAG（AAV2/PHP.eB），尾静脉注射感染小鼠脑部，促使小鼠海马区过表达SERPINA3N蛋白（图8）。

图8 尾静脉注射AAV-CMV-Serpina3n-2A-mScarlet-3FLAG可上调海马Serpina3n的表达

通过癫痫发作等级评估，他们发现，转染AAV-Serpina3n可导致小鼠癫痫发作评分显著升高，此外，被动回避行为学实验结果发现，AAV-Serpina3n可显著降低步入潜伏期（与TMT+MEL组相比，图9）。这提示了小鼠海马区过表达SERPINA3N蛋白后，可有效阻断melatonin对TMT引起神经毒性的保护作用。

图9 过表达SERPINA3N抑制了melatonin对TMT引起异常神经行为损伤的保护作用

接下来，为探讨melatonin调控SERPINA3N介导神经炎症的可能机制，他们检测了SERPINA3N过表达对TMT诱导星形胶质细胞活化的影响。结果发现，转染AAV-Serpina3n可显著增加TMT + MEL组小鼠海马星形胶质细胞的增殖和活化（图10）。

图10 过表达SERPINA3N阻断了melatonin对TMT诱导海马星形胶质细胞活化的抑制作用

最后，作者借助qPCR和Western blot分析发现，小鼠脑部过表达SERPINA3N，可阻断melatonin对TMT引起的神经炎症保护作用（图11）。

图11 过表达SERPINA3N可阻断melatonin对TMT诱导海马神经炎症保护作用

综上，这些结果提示了melatonin可改善TMT引起的SERPINA3N表达上调，从而减轻神经炎症反应，而过表达SERPINA3N可阻断melatonin对TMT引起的神经炎症保护作用。进一步表明抑制SERPINA3N依赖性神经炎症是melatonin拮抗TMT神经毒性的关键。

结论

    本篇文章借助病毒载体介导的过表达、行为学、分子生物学以及定量蛋白组学等技术手段研究发现， TMT急性暴露可引起小鼠中枢神经系统损伤，而melatonin能有效逆转TMT急性暴露所造成的学习记忆损伤并减少小鼠大脑海马区神经元丢失。进一步研究发现SERPIAN3N是melatonin拮抗TMT引起神经毒性的关键分子靶点，其特异性地表达于海马区星形胶质细胞。借助AAV病毒载体在小鼠海马区过表达SERPINA3N蛋白后，可有效阻断了melatonin对TMT引起神经毒性和神经炎症的保护作用。证明了抑制SERPINA3N依赖性神经炎症是melatonin拮抗TMT神经毒性的关键，该研究为发现melatonin的多种生物学功能，以及临床治疗重金属污染对公众健康造成的损害提供了新的视角。

    文中借助病毒载体实现的过表达已广泛用于体内的基因操作，和元上海有幸提供实验中使用的AAV病毒（AAV-CMV-Serpina3n-2A-mScarlet-3FLAG（AAV2/PHP.eB跨血脑屏障血型，尾静脉注射）），用实际行动助力中国脑科学的发展。

参考文献：

[1] Huifeng P, Zhou Z, et al. Inhibition of SERPINA3N‐dependent neuroinflammation is essential for melatonin to ameliorate trimethyltin chloride–induced neurotoxicity. doi: 10.1111/jpi.12596.

[2] Zamanian JL, Xu L, Foo LC, et al. Genomic analysis of reactive astrogliosis. J Neurosci. 2012;32(18):6391‐6410.

[3] Liddelow SA, Guttenplan KA, Clarke LE, et al. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia. Nature.2017;541(7638):481‐487.

[4] Hartlage‐Rübsamen M, Waniek A, Meißner J, et al. Isoglutaminyl cyclase contributes to CCL2‐driven neuroinflammation in Alzheimer's disease. Acta Neuropathol. 2015;129(4):565‐583.

[5] Jha MK, Kim J‐H, Song GJ, et al. Functional dissection of astrocyte‐secreted proteins: implications in brain health and diseases. Prog Neurogibol. 2018;162:37‐69.

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