【Nat. Neurosci.】傲雪凌霜！马普所揭示机体应对负面情绪的环路机制

“亭亭山上松，瑟瑟谷中风。

风声一何盛，松枝一何劲。

 冰霜正惨凄，终岁常端正。

   岂不罹凝寒，松柏有本性。”

—魏晋·刘桢《赠从弟》（其二）

图片来源：古诗学习网

正如傲雪凌霜的松柏，生活中面对困境时，我们披荆斩棘，乘风破浪，战胜艰难险阻，一步步实现人生目标。在此过程中，我们的机体感知负面状态并作出适应性调整。除人类以外，这种适应性功能对其它生物的生死存亡同样至关重要。

图片来源：Liz Burton个人主页

过去研究表明，岛叶皮质后部（posterior insular cortex, pIC）整合机体内、外部环境信息，处理多种功能[1-5]。但是pIC如何表征身体内部状态以及如何介导相关适应性行为，我们尚未可知。

pIC在大脑中的位置

图片来源：University of Freiburg

2019年8月27日，《Nature Neuroscience》杂志在线刊登了德国马克思普朗克神经生物学研究所Nadine Gogolla研究组的最新重要工作[6]，他们发现pIC通过不同下游编码机体对抗负面状态引起的多种行为。这项研究揭示了介导负面状态相关适应性行为的神经环路机制，极大提高了人们在负面状态相关神经疾病领域的认知。 

Nadine Gogolla, PhD

图片来源：Max Planck Institute of Neurobiology

结果

1

光激活pIC诱发防御行为和自主神经反应

为探究pIC编码的功能，作者在小鼠pIC双侧注射AAV-CaMKIIα-ChR2或AAV-CaMKIIα-eNpHR3.0并植入光纤（图1a），发现光激活pIC引起梳毛、下颌运动、颤栗和躲避行为（图1b-d）。在麻醉小鼠中，光激活pIC增加呼吸频率，光抑制pIC无影响（图1e）。以上结果表明激活pIC产生一种负面信号，引起小鼠产生防御性反应。 

图1 光激活pIC诱发防御行为和自主神经反应

2

pIC参与并调控焦虑行为

为探究何种状态与刺激引起pIC激活，作者使用光纤钙信号记录方法，在小鼠pIC中注射AAV-CaMKIIα-GCaMP6s（图2a），将小鼠置于高架十字迷宫（EPM）或高架O迷宫（EZM）中。在两种高架迷宫中，小鼠在开放臂的焦虑水平更高。他们发现，小鼠在开放臂中pIC活性较低，且在开放臂中逗留时间更长（焦虑水平更高）的小鼠在开放臂中pIC活性更低（图2b-d）。此外，小鼠撤离开放臂时，pIC活性升高；小鼠接近开放臂时，pIC活性降低（图2e-h）。

为研究pIC是否调控焦虑行为，作者在小鼠pIC中双侧注射AAV-CaMKIIα-ChR2或AAV-CaMKIIα-eNpHR3.0并植入光纤，发现光抑制pIC增加开放臂探索，光激活pIC减少开放臂探索（图2i-l）。

以上结果表明pIC活性与小鼠焦虑水平呈正相关，操控pIC神经元可充分改变小鼠焦虑水平。 

图2 pIC参与并调控焦虑行为

3

pIC介导持续性焦虑

为进一步探索pIC是否参与焦虑状态的产生，作者研究短暂操控pIC神经元活性是否产生持续性行为学效应。他们继续使用上文中光遗传学方法，给予小鼠20Hz光刺激10次，每次持续1秒，然后将小鼠置于EPM中，发现小鼠在开放臂中逗留时间显著减少；NpHR3.0实验中，作者先使用足底电击范式提升小鼠焦虑水平，在此过程中光抑制pIC，再将小鼠置于EPM中，发现小鼠在开放臂中逗留时间显著增加（图3a-d），表明短暂操控pIC神经元活性可以引起小鼠焦虑水平的持续性变化。

为排除NpHR3.0实验中恐惧情绪带来的影响，作者在场景恐惧范式足底电击或场景回忆过程中光抑制pIC，发现小鼠恐惧行为及恐惧记忆并不受影响（图3e-f）。 

图3 短暂操控pIC引起焦虑水平的持续性变化

4

pIC中厌恶性刺激与状态的单细胞表征 

上文已知，pIC介导焦虑等负面情绪。但是，我们并不知清楚负面情绪如何在pIC中产生与处理。过去研究表明，岛叶皮层接受多信息流输入[2]，于是作者探究不同情绪性刺激如何由pIC处理。

他们引入双光子钙成像方法，在小鼠pIC中注射AAV-CaMKIIα-GCaMP6s，给予小鼠尾部电击、糖水或奎宁溶液以表征痛觉、奖赏性、厌恶性刺激，发现28% pIC神经元被尾部电击激活，49%被奎宁溶液激活，10%被糖水激活，7%被恐惧性颤栗激活（图4a-e）。

接着，为探究pIC在单细胞水平如何表征焦虑状态，作者比较小鼠在条件恐惧学习后（高焦虑状态）与条件恐惧消退后（低焦虑状态）pIC神经元的活性，发现前者显著高于后者（图4g）。

再然后，作者探究pIC在单细胞水平如何表征机体厌恶性状态，他们通过腹腔注射氯化锂溶液或水剥夺处理以引起小鼠身体不适，发现大量pIC神经元被这两种负面状态激活（图4g）。

统计结果显示，23.5%神经元被多种刺激激活；超过50%神经元被焦虑状态激活，12.2%神经元被焦虑状态与痛觉刺激激活；超过99%神经元参与身体状态检测，其中75%参与多种厌恶性状态检测（图4f, h）。  

图4 pIC中厌恶性刺激与状态的单细胞表征

5

pIC的上、下游脑区

为进一步探究pIC如何处理机体厌恶性状态，作者通过神经元示踪方法研究其上、下游脑区。他们在CaMKIIα-Cre小鼠的pIC中注射辅助病毒AAV与狂犬病毒RV以实现逆行示踪，注射AAV-DIO-eYFP以实现顺行示踪（图5a-b），发现pIC主要接受感觉皮层、杏仁核与丘脑的投射，主要投射到皮层、伏隔核、杏仁核与丘脑（图5c-e,h-i）。其中，pIC与各皮层之间产生互相投射，而pIC与亚皮层各脑区之间很少互相投射（图5f-g）。 

图5 pIC的上、下游脑区

6

投射到CeA与NAcC的pIC神经元分属不同亚群 

过去的研究表明，中央杏仁核（CeA）与伏隔核核部（NAcC）参与并调控焦虑、厌恶与奖赏等功能[7-9]，且这两个脑区为pIC的主要下游（图5c），于是作者推测此二脑区介导pIC参与的功能。

为研究投射到CeA与NAcC的pIC神经元是否为同一集群，作者在小鼠CeA与NAcC中分别注射红、绿色CTB（图6a-b），发现pIC中CeA与NAcC的上游神经元极少共标，其中CeA上游神经元分布靠后，NAcC上游神经元分布靠前（图6c-f）。他们又在CaMKIIα-Cre小鼠Bregma -0.5 mm位置注射AAV-DIO-eYFP，找到了CeA与NAcC中eYFP阳性神经纤维最密集的区域（图6g-j），为下文中的光纤埋植位点提供最优坐标。 

图6 投射到CeA 与NAcC 的pIC神经元分属不同亚群

7

pIC→CeA与pIC→NAcC环路介导不同功能

为探究pIC→CeA和pIC→NAcC环路的功能，作者在小鼠pIC中注射AAV-CaMKIIα-ChR2或AAV-CaMKIIα-eNpHR3.0，在CeA或NAcC植入光纤（图7a-b），发现光激活pIC→CeA环路增加厌恶性行为、躲避行为、呼吸频率以及焦虑行为，而光激活pIC→NAcC环路无此现象。此外，光抑制pIC→CeA环路减少焦虑行为（图7c-n）。 

图7 pIC→CeA介导厌恶、焦虑行为与自主神经反应

过去研究表明，CeA与NAcC均参与满足行为[7, 9, 10]。满足行为是一种高动机行为，例如在危险的条件下获取奖赏，“贪夫徇财，烈士徇名”是其典型案例。接下来，作者探究CeA与NAcC是否介导pIC调控满足行为。

他们使用与上文相同的光遗传学操控方法，发现光激活两条环路均会显著减少小鼠饮用糖水的时程，而光激活、抑制两条环路不影响小鼠对糖水的偏好性（图8a-e）。与之相似，光激活两条环路均会中断小鼠进食，减少其进食量（图8f-h）。此外，光激活pIC→CeA而非pIC→NAcC环路会中断小鼠社交过程，但小鼠社交总时间维持不变（图8i-k），表明pIC→CeA环路并不影响小鼠社交动机。

厌恶性状态引起饥饿小鼠厌食，最后，作者探究两条环路在此过程中的作用。他们发现，光抑制pIC→NAcC环路后，身体不适或焦虑气味引起的厌食现象有所缓解，而光抑制pIC→CeA环路无任何影响（图8l-r）。

综上所述，pIC→CeA环路介导厌恶、焦虑行为与自主神经反应，pIC→NAcC介导满足行为。

图8 pIC→NAcC介导满足行为

总结负面状态的感知与其适应性行为对各类生物的生存十分重要，但是究其相关神经环路机制，我们知之甚少。本篇文章结合光纤钙信号记录、光遗传学、双光子钙成像与神经元顺、逆行示踪等方法，发现pIC编码负面状态引起的各类行为，其中pIC→CeA环路介导厌恶、焦虑行为及其相关自主神经反应，pIC→NAcC环路介导满足行为。这项研究阐释了机体应对负面情绪的神经环路机制，为临床治疗焦虑症等负面情绪相关疾病提供有力支持！

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参考文献

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2.Kurth, F., et al., A link between the systems: functional differentiation and integration within the human insula revealed by meta-analysis. Brain Structure & Function, 2010. 214(5-6): p. 519-534.

3.Critchley, H.D., et al., Neural systems supporting interoceptive awareness. Nat Neurosci, 2004. 7(2): p. 189-95.

4.Craig, A.D., Interoception: the sense of the physiological condition of the body. Curr Opin Neurobiol, 2003. 13(4): p. 500-5.

5.Simmons, W.K., et al., Keeping the body in mind: insula functional organization and functional connectivity integrate interoceptive, exteroceptive, and emotional awareness. Hum Brain Mapp, 2013. 34(11): p. 2944-58.

6.Gehrlach, D.A., et al., Aversive state processing in the posterior insular cortex. Nat Neurosci, 2019. 22(9): p. 1424-1437.

7.Namburi, P., et al., Architectural Representation of Valence in the Limbic System. Neuropsychopharmacology, 2016. 41(7): p. 1697-715.

8.Floresco, S.B., The nucleus accumbens: an interface between cognition, emotion, and action. Annu Rev Psychol, 2015. 66: p. 25-52.

9.Fadok, J.P., et al., New perspectives on central amygdala function. Curr Opin Neurobiol, 2018. 49: p. 141-147.

10.Schiff, H.C., et al., An Insula-Central Amygdala Circuit for Guiding Tastant-Reinforced Choice Behavior. J Neurosci, 2018. 38(6): p. 1418-1429.