【Nature子刊】不做“最熟悉的陌生人”，上海交通大学徐楠杰/孙苏亚课题组合作发现初始社交记忆形成的分子机制

社交行为，是指在一定的环境条件下，个体之间相互往来，进行物质、精神交流的社会活动，是生存和繁衍至关重要的环节。在与同伴进行沟通互动时会需要识别记忆这一功能，即记住和辨别不同个体的能力。这是生活在社会或群体中的社交动物进行社会行为的重要过程。然而，社交识别记忆受损，往往会导致群居动物的行为异常，严重者会导致各种精神类疾病如自闭症、精神分裂症、双相情感障碍以及抑郁症等。

不同的社交行为由大脑特定的区域响应[1]，然而关于调控初始社交识别记忆形成的特定核团以及相关的分子机制仍处于初步探索阶段。

2019年11月26日，《Molecular Psychiatry》杂志发表了上海交通大学基础医学院解剖学与生理学系徐楠杰课题组和上海交通大学医学院附属瑞金医院孙苏亚课题组合作题为“Hippocampal Lnx1–NMDAR multiprotein complex mediates initial social memory”的最新重要工作[2]。该研究发现了幼年小鼠大脑中Lnx1蛋白参与的突触后多蛋白复合体在初始社交记忆形成中的重要作用，揭示了参与幼年期社交识别记忆的特异细胞以及内在的分子机制，为治疗社交记忆异常相关疾病提供了新的思路。

Lnx1蛋白
Ligand of Numb protein X，是LNX泛素连接酶家族的4个成员之一，是第一个被发现的含有PDZ结构域的RING类型的泛素连接酶E3。LNX1被报道通过其1个或多个PDZ结构域与许多胞内重要蛋白发生互作，参与多种信号通路。

PDZ结构域
是介于二级和三级结构之间的另一种结构层次，包含80到100个氨基酸残基组成的保守序列，是一类重要的蛋白质/蛋白质相互作用结构域。PDZ结构域最初是在PSD-95（突触后密度蛋白），DLG4（膜相关性鸟苷酸激酶蛋白家族的一种）以及ZO-1（紧密连接蛋白-1）这三种蛋白中首次被发现。含有PDZ结构域的蛋白质通常没有酶活性，一般定位于细胞膜表面附近，与细胞表面膜蛋白的C末端序列结合，对细胞膜表面的受体/通道等进行聚合和定位[3]。因此，含有 PDZ 结构域的相关蛋白也称为支架蛋白 (scaffold protein)。

EphB2
是酪氨酸蛋白激酶受体家族中的一员, 被其配体Ephrin-B激活而导致细胞内蛋白磷酸化，参与大脑发育和神经精神疾病的发生过程。徐楠杰课题组在过去数年中持续关注EphB受体家族介导的细胞间信号在神经发育过程中的调节作用，曾发表系列文章阐述Ephrin-B和EphB在大脑神经元发育和突触形成过程中的调节机制[4-7]。

结果

1、Lnx1参与初始社交记忆识别过程

首先，为了识别响应各种社会刺激的大脑区域，作者引入了一种社会行为范式[8]来观察比较目标小鼠与空环境（放置空笼子）、陌生小鼠（放置陌生小鼠并用同样的笼子罩住）和熟悉小鼠（放置同窝出生小鼠并用同样的笼子罩住）的社交互动行为（图1a），并检测c-Fos[9]的表达，结果发现，在目标小鼠与熟悉小鼠互动时，海马CA1、CA3亚区中的c-Fos阳性细胞数明显增加（图1a），提示了这些脑部区域可能参与了对熟悉小鼠的社会认知过程。

在大脑发育过程中，突触后结构动力学对海马体内在信号整合的调控是早期认知功能产生的基础[10-11]。基于之前的研究，研究人员已经鉴定出一种PDZ支架蛋白Lnx1（Ligand of Numb protein X），其在海马CA3亚区锥体神经元突触后特异性表达，对MF-CA3突触的形成和成熟至关重要[5]。因此，他们测试出生后3周龄（PW3）的Lnx1^−/− 突变小鼠的社交行为，观察c-Fos的表达发现，将该基因敲除后，在目标小鼠与熟悉小鼠互动时，海马CA1、CA3亚区中的c-Fos阳性细胞数并没有增加（与WT小鼠对比，图1a）。随后，研究人员通过计算目标小鼠分别与陌生小鼠和熟悉小鼠互动时被激活c-Fos阳性细胞数的比值发现，Lnx1^−/− 突变小鼠海马中c-Fos阳性细胞模式出现与WT小鼠相反的情况，即c-Fos阳性细胞在Lnx1^−/− 突变小鼠海马DG区表达升高，在CA3和CA1区表达下降（图1b）。

同时，三箱社交行为学实验[12]结果显示，面对陌生小鼠，Lnx1^−/−小鼠表现出类似WT小鼠的社交性指数以及对新颖事物的社交回避反应，提示了其具有正常的社交行为；随后，当引入熟悉小鼠时，Lnx1^−/−小鼠对其辨别能力明显下降，且这种识别能力缺陷可能是由于初始社交记忆的损伤所致（图1c-d）。

图1 Lnx1参与社交识别记忆识别过程

2、Lnx1对海马CA3神经元活动和突触传递至关重要

为了研究社交过程中神经元的实时活动，作者借助基因编码钙指示剂GCaMP6，结合光纤记录系统对社交过程中小鼠海马CA3区神经元Ca²⁺信号进行记录。研究人员在出生后第一天（P1）小鼠海马CA3区注射AAV-hSyn-GCaMP6病毒，三周后埋入光纤（图2a），结果发现，与WT小鼠相比，在与熟悉小鼠互动时，Lnx1^−/−小鼠的Ca²⁺信号明显减少（图2b-d），同时，WT小鼠海马CA3神经元活动随着时间的推移表现出下降的趋势，而Lnx1^−/−小鼠无此现象，且其神经元活动交替性发作增加（图2e,f），提示了Lnx1缺失小鼠的社交识别记忆受损。

之前的研究发现，Lnx1是DG-CA3突触形成所必需的[5]，基于此，研究人员借助全细胞膜片钳记录发现，Lnx1^−/−小鼠海马CA3锥体神经元mEPSC（微小兴奋性突触后电流）频率和振幅降低（图2g），提示了海马CA3区突触活动降低，突触传递下降。

NMDAR和AMPAR谷氨酸受体：NMDAR和AMPAR与记忆的形成密切相关[13-14]，因此，作者检测了MF-CA3和SC-CA1突触的NMDAR/AMPAR比值发现，Lnx1^−/−小鼠MF-CA3突触NMDAR/AMPAR比值降低（图2h）。这些数据提示了Lnx1在建立完整的功能突触方面发挥着关键作用，这些功能突触参与社交记忆的识别。

图2 Lnx1缺失降低了海马CA3神经元的突触活动及小鼠的社交识别记忆

3、Lnx1以分子脚手架的方式与NMDA和EphB2受体结合，形成多蛋白复合物

海马谷氨酸受体与PDZ支架蛋白相互作用参与认知过程[15]，为探究Lnx1参与社交记忆识别的分子机制，作者借助Co-IP（免疫共沉淀）技术发现，Lnx1与海马内NMDAR，特别是GluN1和GluN2B这两个亚基，发生互作，且结合位点是在Lnx1的第一个PDZ结构域（图3a-d）。

作者先前的研究发现，Lnx1与EphB2（参与神经元轴突和树突发育的重要信号分子家族）通过其第二个PDZ结构域发生互作[5]，基于此，研究人员进行深入研究发现，EphB2和GluN2B几乎没有直接的相互作用，Lnx1的存在则大大增加了这种相互作用，且Lnx1-GluN2B-EphB2复合体的形成依赖于Lnx1的前两个PDZ结构域（图3e）。

图3 Lnx1以分子脚手架方式与NMDA受体和EphB2受体结合，形成多蛋白复合物

接下来，作者对Lnx1缺失对NMDAR表达产生的影响进行探究，研究人员纯化了海马突触后致密部蛋白（PSD）发现，在PW3和PW6 Lnx1^−/−小鼠中，GluN2B水平所下降，而GluN1水平保持不变（图4a）。同时，当加入Ifenprodil（GluN2B拮抗剂）时，Lnx1^−/−小鼠中NMDAR / AMPAR比率降低，而加入PEAQX（GluN2A拮抗剂）时则无此现象（图4b）。免疫染色结果显示，GluN2B水平下调发生在海马CA3区（图4c）。Western blotting结果发现，Lnx1缺失的海马原代神经元总蛋白和膜蛋白中的GluN2B水平均降低，过表达Lnx1蛋白后可恢复到正常水平(图4d)。这些数据提示了Lnx1对于海马CA3神经元突触后GluN2B表达的稳定性至关重要。

图4 Lnx1参与海马CA3神经元突触后GluN2B表达的稳定性

4、Lnx1-NMDAR-EphB2多蛋白复合物对社交记忆至关重要

最后，作者借助病毒注射技术在海马CA3区分别过表达Lnx1蛋白（Lenti-Lnx1-3XFLAG-GFP）和PDZ结构域突变的Lnx1蛋白（Lenti-Lnx1-△PDZ1-3XFLAG-GFP, Lenti-Lnx1-△PDZ2-3XFLAG-GFP），三周后进行三箱社会新奇行为学实验（图5a），结果显示，过表达PDZ结构域突变Lnx1蛋白（Lnx1-△PDZ1, Lnx1-△PDZ2）的WT小鼠的社交指标显著降低，社会新奇回避指数显著上升，即干扰Lnx1蛋白与NMDAR或EphB2的相互作用会损伤社会记忆的形成。相比之下，在Lnx1^−/−小鼠中，过表达Lnx1蛋白的社会记忆得到了改善，而过表达PDZ结构域突变Lnx1蛋白的则无明显变化，此外，过表达EphB2（Lnx1^−/−小鼠海马CA3区注射Lenti-EphB2病毒载体）也观察到了小鼠社交记忆的改善(图5b)。

研究还发现，Lnx1^−/−小鼠海马CA3区过表达Lnx1或是EphB2蛋白后， NMDAR/AMPAR比值基本达到正常水平，且c-Fos阳性神经元数也得到了很大程度的改善（图5b-d）。然而，过表达Lnx1可以恢复PSDs中GluN2B水平，而过表达EphB2则不能，提示了EphB2对突触功能和社交记忆的改善作用不依赖于Lnx1或GluN2B表达水平的维持(图5e)。

综合上述结果，Lnx1能够以分子脚手架的方式分别与NMDA受体以及EphB2受体结合，形成Lnx1-NMDAR-EphB2多蛋白复合物并锚定在突触后膜上，从而介导发育中神经元的突触功能，参与小鼠的社交识别记忆的形成(图5f)。

图5 Lnx1-NMDAR-EphB2多蛋白复合物对社交记忆至关重要

结论：

本篇文章借助病毒注射、在体光纤记录、基因敲除、行为学实验、Co-IP等分子生物学技术手段研究发现，特异性表达于CA3区神经元的PDZ支架蛋白Lnx1能够调控社交识别记忆的形成，这主要是由于Lnx1能够以分子脚手架的方式分别与突触后重要记忆分子NMDA受体以及EphB2受体结合，形成多蛋白复合物并锚定在海马CA3区突触后膜上，从而介导神经元的突触功能，且这个多蛋白复合物的形成和稳定对于社交识别记忆能力至关重要。该研究为理解孤独症等精神类疾病的社交行为异常提供了新的思路。

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参考文献：

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