外泌体分离：超速离心法PK试剂盒法，谁赢了？
什么是外泌体？
外泌体的作用和功能
外泌体可通过传递信息影响目标细胞的功能，激活细胞信号通路，在免疫、凝血、肿瘤等生理病理过程中发挥作用。外泌体可以作为临床诊断中的生物标志物或疾病治疗的靶点，同时也可以作为药物载体，参与神经疾病和癌症等多种疾病的病理过程。
关键步骤—外泌体分离
外泌体的分离纯度对外泌体的功能研究非常重要，但是外泌体的分离一直是困扰外泌体研究人员的一个难题。虽然分离外泌体方法有很多种，包括差速超速离心法（超离法）、超滤法、密度梯度离心法、免疫磁珠法、试剂盒法等，但目前文献中常用的分离外泌体的方法主要是超离法和试剂盒法，那这两种方法研究人员该如何选择呢？为了解决大家的疑惑，我们专门做了对比实验进行阐述。
超速离心法与试剂盒法比较
开展的实验包括外泌体分离、透射电镜（TEM）、纳米颗粒检测（NTA）、BCA、WB。
二、实验结果如下：
外泌体分离方法：此处步骤比较长，内容篇幅有限，暂且省略步骤，如有需要，可在微信公众号下面留言。 透射电镜拍摄：先制片，再拍摄。制片是先将外泌体固定在铜网上，再用2%醋酸双氧铀染色液染色，随后放于灯下烤10min，再拍照。
从上面的图片中可以看出，超离法相比较两种试剂盒的分离效果，纯度较高，电镜图片更清晰。
纳米颗粒大小检测：将外泌体样本进行稀释并检测，仪器自动出分析报告。
从上图结果可以看出，超离法和试剂盒法得到的外泌体大小差不多，基本在110-120nm，颗粒数浓度也相似，在3*10的10次方particles/ml左右。
BCA蛋白浓度测定结果：将外泌体样本进行BCA蛋白浓度测定，结果如下表。
| 样本名 | BCA浓度（ug/ul） |
| UC-1 | 0.18 |
| UC-2 | 0.14 |
| SXX-1 | 1.60 |
| SXX-2 | 1.87 |
| UXX-1 | 2.10 |
| UXX-2 | 3.10 |
WB检测标志物：根据上述的BCA定量结果，制备样本，上样，做WB。
超离法由于BCA测定的浓度数值低，用了最大上样量25ul，试剂盒法用的体积少一些，换算后每孔的蛋白总量如下：
| 样本名 | 蛋白总量ug/孔 |
| UC-1 | 4.50 |
| UC-2 | 3.50 |
| SXX-1 | 25.00 |
| SXX-2 | 25.00 |
| UXX-1 | 25.00 |
| UXX-2 | 25.00 |
选用外泌体标志物CD9和TSG101作为本次的检测指标，实验结果如下：
1、在CD9指标检测中，超离法的两个样本UC-1和UC-2尽管每孔只用了4.5ug的总蛋白，但是两孔中都能明显看到CD9的蛋白条带，而试剂盒样本SXX-1、SXX-2、UXX-1和UXX-2每孔用了25ug蛋白，但是仍旧没有看到条带出现。
2、在TSG101指标检测中，上样量和CD9的一样，超离法和试剂盒法共6个孔都出现了条带，但是超离法的UC-1和UC-2条带亮度比较显著。
实验结论分享
通过本次对超离法和试剂盒法效果的比较，可以发现，超离法经过多次离心步骤，可以获得纯度较高的外泌体，但是也会有一定的外泌体损失。试剂盒法虽然得到较多的外泌体，但是也有很多杂质混在一起。每种方法都有利弊，可以根据自己的需求选择合适的方法。
建议：如果做外泌体示踪、细胞功能学或动物实验，尽量选择用超离法做，一方面这类实验外泌体需求量比较大，超离法的通量较大，比较适合；另一方面这些实验对外泌体的纯度要求比较高，超离法的杂质去除相对比较干净，不至于让别人怀疑实验的其他可能性。
如果您对我们的实验数据有任何疑问，欢迎在微信公众号下方留言，我们将逐一解答。
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