免疫治疗丨免疫检查点抑制剂生物标志物之肠道微生物

本期内容较多，慎入！

随着肿瘤免疫治疗时代的到来，免疫检查点抑制剂的研发和审批的进步，确保了免疫检查点抑制剂已经作为肿瘤治疗的新的有效方法之一。临床研究显示，单独使用PD-1抑制剂，只有20-40%的病人会对免疫治疗产生反应，医生很难知道免疫疗法是否对某个病人有效，如何筛选出这部分有应答的患者则是临床所面临及需要解决的问题 。（经典型霍奇金淋巴瘤是一个例外，单独使用，有效率高达80%以上）

有没有生物标志物（Biomarker）能够预测对免疫检查点抑制剂的反应？开发生物标志物对于帮助患者分层以及预估患者是否对免疫阻断单独疗法有反应，是否需要组合疗法或者接受其他的治疗是必要的。

精准医学始于靶向治疗，免疫治疗从一开始就在思考能否利用靶向治疗开辟新的成功路径。就目前而言，免疫治疗已经开辟了通向精准治疗的各种路径。

对ICBs标志物的一些看法

其实，关于免疫检查点抑制剂的Biomarker写了这么多期，很多读者都会问，到底哪个才是最佳的Biomarker？说实话，小编也不好确定（在此篇正文开始之前，先给予一点回答），因为：

1，每个Biomarker之间有些是独立的（比如TMB与PD-L1），有些是有关联的（比如TMB与MSI）。若检测结果出现矛盾的时候，其实临床获益很难说（一般认为Biomarker是独立的，任何一个预测疗效好，都可以获益，其实并不完全是）

2，每个Biomarker都有癌种的限制，或者说每个Biomarker针对不同的癌种可能都应该有不同的cut off值（TMB、PD-L1等），并不能作为广谱Biomarker来使用。如果非要说MSI-H/dMMR是FDA首个批准的针对泛实体瘤的ICBs的Biomarker，这个我也承认。但是在膀胱尿路上皮癌、胶质母细胞瘤、乳腺癌等这些癌种中，MSI-H/dMMR的发生频率低于2%，是不是这时候选择MSI-H/dMMR作为一种Biomarker就不太合适了呢？比如尿路上皮癌中，如果选择MSI-H/dMMR作为Biomarker，那么最多也就2%的人可以用ICBs，但是FDA批准的PD-1抑制剂适应症中，全部都包含尿路上皮癌，甚至不做Biomarker，盲用PD-1抑制剂的有效率都能达到15-24%，这时候做MSI的意义何在？当然如果反推发生MSI-H/dMMRI效果更好，我承认，但是针对不同的癌种来说，都应该有自己的Biomarker或者cut off值，在尿路上皮癌中，DDR基因缺陷可能就是一种很好的Biomarker。（TMB，PD-L1其实也并适用于所有的癌种，看几篇文献，其中道理相信大家也都会自然明白）

3，每个Biomarker的检测都有自己的优缺点，优点姑且不说，缺点自然是很多，相信专业的人士，都能说出一堆缺点。现在免疫治疗治疗这么火，小编可不敢浇一盆凉水。但是小编认为：虽然不能要求每个Biomarker检测都是完美的，但是至少要保证基于目前的技术方法或者分析手段，检测机构可以呈现出一个可靠的结果给医生或者患者，而不是一个不负责任的结果。就目前市场而言，大部分基因检测公司/医检所/医院都说自己可以做PD-L1表达，可以做MSI，可以做TMB，可以做Neoantigen预测等等，似乎哪一项不会做，就会显得很low。但是你PD-L1抗体的选择与判断标准？你MSI试剂盒的选择与判断标准？你TMB检测的基因多少，区域大小，算法与判断标准？你Neoantigen是否算了SNV与Indel产生的新抗原，判断亲和力的cut off值多少？这些都会对检测的结果产生质变（问题远不止这些，还有很多很多）。所以这时候，你选择检测公司的时候，就要看这家公司靠不靠谱了：

为什么要在此说这么多呢，就是因为小编之前偶尔接触过一家检测机构的TMB检测报告，受检者（30多岁女性）体检发现是肺部早早期 0.5微浸润腺癌（预后一般很好），受检者被一家检测机构找到并要求做TMB检测，看适不适合免疫治疗。

检测选择的样本类型是血液，panel是500基因左右，ctDNA检测深度：10,000X，检测结果呈现的是血液的TMB值：44.98 Mutations/Mb，可能偏高。44.98是可能偏高？？？报告中并未发现可能致使TMB偏高的基因突变，比如MMR基因等。就肺癌而言（FFPE样本检测），肺腺癌的TMB中位值是6.3 Mutations/Mb，肺鳞癌的TMB中位值是5.4 Mutations/Mb，44.98 Mutations/Mb是血液的TMB值，还可能偏高？这应该是很高了吧（血液TMB一般低于组织TMB，可能与样本浓度有关）。

TMB为什么这么高呢？检测机构给出的解释是他们的TMB算法加了synonymous mutation（同义突变），但是synonymous mutations list并不愿意给出来，这可能与他们的ctDNA算法过滤条件不严格有关，很多假阳性，不敢给；其次TMB算法加入了synonymous mutation，就等于效仿了Foundation Medicine的TMB算法，但是加了synonymous mutation后，算TMB是需要去掉一些TSG基因功能失活突变与Hotsports mutations的，如果没有严格理解FMI的TMB算法，那么结果肯定不靠谱！具体关于TMB的算法（比较FMI和MSK及WES三者算法的TMB关系）可以看看：

该检测机构依据血液的TMB是44.98 Mutations/Mb，随后就推荐受检者使用PD-1抑制剂，可以港澳及美国代购，一盒5-6W（高于市场价）。针对于早早期微浸润腺癌，ctDNA 10,000X深度，能检测出这么多突变，还做什么用药指？还卖什么药？去做肿瘤早筛吧，定能赚的盆满钵满。所以，选择靠谱的基因检测公司很重要！

4，免疫治疗是个复杂的免疫系统关系，除了小编写的这些Biomarker（PD-L1，MSI，dMMR，TMB，Neoantigen，HLA，DDR）以外，还与肿瘤的微环境，浸润淋巴细胞数量及功能，男女性别（近期研究发现男性比女性疗效好）等有关。临床除了要分析这些常见的Biomarker以外，还应该对与ICBs有关的敏感基因及超进展相关基因突变进行分析。有些基因与ICBs的关系就是个case report，类似于GWAS的筛选，看看每个基因的HR值，每个基因其实还是独立的Biomarker，相同的基因不同的研究，甚至结论都会相反（比如KRAS基因），这就会带来一系列不统一的结论。所以针对这些基因，要看证据等级如何，比如指南有没有收录，文献报道的话，看文献影响因子如何，研究的样本数量等等。小编大致整理了下：PBRM1、DNMT3A、TP53、POLD1、MDM2/4、BRAF、KRAS、DDR（包括MMR；比如BRCA、POLE、ATM、MSH2、MSH6、ERCC2、FANCA、CHEK2等）、PMS2启动子区域等基因变异可能与ICBs敏感相关；EGFR、ALK、ROS1、JAK1/2、PTEN、B2M、STK11等基因变异可能与ICBs耐药相关。（工作量较大，小编也只是业余时间收集，如有遗漏欢迎留言指出）

很抱歉写了这么久，没有将ICB和ICI的全称写出来，因为小编默认大家都明白的，ICB和ICI都是免疫检查点抑制剂的意思，其实，有时候也会写作ICPI，包括CTLA-4和PD-1抑制剂。ICB：Immune checkpoint Blockade；ICI：Immune checkpoint inhibitor。

ICBs与肠道微生物的关系

目前，影响 Immune checkpoint inhibitor（免疫检查点抑制剂）的有效生物标志物包括：PD-L1，MSI，dMMR，TMB，Neoantigen，HLA，DDR等，更多反映免疫疗效的生物标志物还在不断的研究与试验中。

今天我们聊聊肠道微生物群（Gut microbiota），目前基因组研究比较火热的一个是人体基因组，另一个则是宏基因组（微生物组）。肠道微生物是一个极其复杂的群体，因其重要的作用，常被称为人的“第二基因组”，如果搞科研的话，要是不和肠道微生物扯上点关系貌似就out了。

近年来，越来越多的研究聚焦于肠道微生物，并且认为肠道微生物有望成为一个潜在的预测免疫治疗疗效的生物标志物。在接受ICBs治疗前后应尽量避免使用抗生素，对部分患者进行粪便移植有望提高免疫治疗疗效，以后可能真的是一个“吃屎的年代”了（不要害怕，不要恶心，不是你YY的那样）。

粪便胶囊

肠道微生物介绍

微生物主要分布在机体与外界相通的腔道内，如呼吸道、消化道、泌尿生殖道以及体表，形成了四个微生态系统。肠道微生物超过99%都是细菌，包括97%严格厌氧菌和3%需氧菌。

人体肠道各部位不同，定殖的细菌数量和种类不同。健康成人的肠道微生物群大约重1.0-1.5kg，大约30个属，500-1000多种，数量高达10¹⁴个，相比于正常人体自身细胞数量10¹³个，肠道微生物的数量是人类细胞数的10倍，而且编码基因数目超过人体自身基因数目的100-150倍。人体每天排出粪便干重的1/3由细菌组成，大多数为肠道细菌。

怎么鉴别肠道微生物？

对的，如何识别鉴定肠道菌群的种类很重要！传统的微生物研究主要依靠培养，但是菌群的种类多，且不同的菌种生长的条件和速度不一，导致无法真实还原微生物的原始状态。宏基因组学研究与传统微生物研究方式的最大区别在于把微生物看成一个整体，摆脱了对单个微生物培养和分离的步骤，直接对环境中所有的微生物进行研究，进而可以全面地对所有微生物进行分析。

宏基因组研究常用手段包括宏基因组测序和16S测序，16S测序主要研究群落的物种组成、物种间的进化关系以及群落的多样性；宏基因组测序则是对全部微生物的总DNA随机打断成500bp的小片段，然后在片段两端加入通用引物进行PCR扩增测序，再通过组装的方式，将小片段拼接成较长的序列，在物种鉴定的过程中，宏基因组测序具有较高的优势。

在肠道菌群的研究中，主要看研究的深度，一般针对16S测序就可以了，通常我们所说的16S是指16S rDNA（或16S rRNA）。其实呢，16S rRNA并不是我们的研究对象，因为我们测序的不是它，而是它对应在DNA双链上的基因序列，也就是16S rDNA，所以，可以这样理解，我们所说的16S 就是指 16S rDNA（当然说16S rRNA也是可以的，意思一样）。

16S rRNA存在于所有细菌的基因组中，是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟（rRNA约占细菌RNA含量的80％），其进化具有良好的时钟性质，在结构与功能上既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，素有“细菌化石”之称。16S rRNA 基因是编码原核生物核糖体小亚基的基因，长度约1542bp，包括9个可变区和10个保守区，保守区序列反映了物种间的亲缘关系，可变区序列则能反映物种间的差异（能体现不同菌属之间的差异）。

16S rRNA拥有9个可变区域

那么怎么进行16S测序呢？因为可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rRNA片段扩增出来，然后进行测序，将得到的测序数据与已有的16S rDNA数据库进行比对分析，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定即可 。

由于受到NGS读长的限制，16S测序我们一般只会选择16S rRNA的某个或某几个变异区域进行扩增测序，目前只能最多测16S九个可变区中的2个，一般为V3+V4区（组合效果最佳：V3+V4高可变区可以高度精确地反映微生物群落中系统进化关系，与16S rRNA全长基因反映的进化关系基本一致。测序一般Miseq PE300优势较大），因此对菌群的分辨率，部分菌种只能分辨到属水平（宏基因组测序能鉴定到种水平甚至菌株水平）。针对不含真核生物的微生物检测，有的公司也可以测V3+V4+V5三个区域（分开分析V3+V4;V4+V5），如果含真核生物，一般不测V5区，因为V5区与真核生物18S基因同源性较高。

16S 测序分析流程

肠道微生物与ICBs的研究关系

近几年的研究显示，肠道微生物可以影响免疫治疗疗效，肠道微生物有望成为一个潜在的预测免疫治疗疗效的生物标志物。

早在2015年11月，Science就曾报道肠道微生物与ICBs之间的关系：

法国Laurence Zivogel博士的研究小组发现，肠道中多形拟杆菌（B. thetaiotaomicron）和脆弱类拟杆菌（B. fragilis）的存在与CTLA-4抗体治疗的疗效有关，而无菌小鼠的肿瘤则对该治疗几乎没有响应。在给无菌小鼠移植特定菌株后（脆弱类杆菌移植），可以增强CTLA-4抗体疗法的有效性（动物实验：小鼠研究）。

芝加哥大学的Thomas Gajewski研究团队，也通过类似的方法，证明了双歧杆菌属（Bifidobacterium）有利于PD-L1抑制剂的抗肿瘤效果（动物实验：小鼠研究）。

近两年比较火热的研究（2017-2018）如下：

研究 一

2017年11月，Science上的《Gut microbiomeinfluences efficacy of PD-1–based immunotherapy against epithelial tumors》还是由两年前的Laurence Zivogel博士团队研究撰写，这次的研究对象从老鼠转移到了人类。

该团队对接受过PD-1抑制剂治疗的249例NSCLC、肾癌等癌症患者进行了分析，其中69例患者因常规原因（如牙科治疗或尿路感染），在接受PD-1治疗前后服用了抗生素。那些服用抗生素的癌症患者，因为抗生素导致肠道菌群紊乱，在接受PD-1抑制剂治疗之后，癌症很快就复发，总体生存期（OS）竟然比未服用抗生素的患者缩短了近45%。

NSCLC+RCC+UC患者中，服用抗生素患者（红色）的总体生存期比未服用抗生素的患者（黑色）显著缩短（11.5 vs 20.6）。

NSCLC患者中，服用抗生素患者（红色）的总体生存期比未服用抗生素的患者（黑色）显著缩短（8.3 vs 15.3）。

RCC患者中，服用抗生素患者（红色）的总体生存期比未服用抗生素的患者（黑色）缩短（4.3 vs 7.4）。

研究者们于是通过对肺癌和肾癌患者的肠道菌群进行取样分析，发现那些抗PD-1疗法治疗效果很差的患者，体内缺乏一种叫做Akkermansia muciniphila的细菌。患者体内Akkermansia muciniphila（Akk菌）的相对丰度与对免疫检查点抑制剂（ICBs）的响应显著相关。将对ICBs响应的患者的粪菌移植给无菌小鼠，可以改善PD-1抑制剂对小鼠肿瘤的效果；移植对ICBs不响应的患者粪菌的无菌小鼠，在口服Akk菌后，也能恢复对PD-1抑制剂的响应。

研究 二

2017年11月，Science上发表《Gut microbiome modulates response to anti–PD-1 immunotherapy in melanoma patients》。

R. R. Jenq教授和J. A. Wargo教授所领导的研究团队分析了112名接受抗PD-1免疫疗法的患者的口腔与肠道菌群发现（通过16S RNA与全基因组测序）：那些对免疫疗法“有反应”的患者，其菌群的组成和多样性均和“无反应”的患者有显著不同，研究对30名免疫疗法“有反应”以及13名“无反应”的患者粪便分析结果表明，前者体内Ruminococcaceae家族的细菌更加丰富。而功能性的分析则进一步发现，前者体内的合成代谢通路更为丰富，系统免疫力与抗肿瘤免疫力也更强。（能够从PD-1抑制剂治疗中获益的患者体内普遍存在Faecalibacterium和Clostridiales两种细菌，而且这类患者的无进展生存期PFS更长）

研究 三

2018年1月，Science上的《The commensal microbiome is associated with anti–PD-1 efficacy in metastatic melanoma patients》还是由两年前的Thomas Gajewski团队研究撰写。

研究人员通过对42名转移性黑色素瘤患者的粪菌构成进行分析，结果证明患者肠道菌群与PD-1免疫疗法的效果之间存在显著关联，并在对治疗响应明显的患者肠道菌群中，鉴定出高丰度的长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）、产气柯林斯菌（Collinsella aerofaciens）和屎肠球菌（Enterococcus faecium），并发现在给无菌小鼠移植这些人类患者的肠道微生物后，能够显著增强小鼠的肿瘤免疫应答和肿瘤控制。

研究 四

此项研究与报道一的研究类似，在肾细胞癌和非小细胞肺癌患者中，使用了广谱抗生素，患者的生存期明显缩短。

2018年3月，Ann. Oncol发表《Negative association of antibiotics on clinical activity of immune checkpoint inhibitors in patients with advanced renal cell and non-small cell lung cancer》，Bertrand Routy博士等团队研究发现：RCC和NSCLC患者，在使用PD-1/PD-L1抗体治疗的最初30天内使用了广谱抗生素，患者的生存期明显缩短。此项研究中，121名肾癌患者中的16名（13%）和239名非小细胞肺癌患者中的48名（20%）接受了抗生素治疗。使用的抗生素最常见的为β-内酰胺类或喹诺酮类抗生素，用来治疗尿路感染或肺炎。

RCC患者中，使用抗生素的患者有更明显的疾病进展风险（75% vs. 22%），缩短的无疾病进展生存期（1.9个月 vs. 7.4个月），以及缩短的总生存期（17.3个月 vs. 30.6个月）。NSCLC患者中，抗生素的使用似乎不太影响疾病进展风险（52% vs. 43%），但明显缩短了无疾病进展生存期（1.9 个月vs. 3.8个月）和总生存期（7.9个月 vs. 24.6个月）。

通过以上研究，可以认为：PD-1治疗期间，使用广谱抗生素，比如β-内酰胺类或喹诺酮类抗生素，可能会明显降低PD-1的疗效，明显缩短生存期。但是，是不是所有的抗生素都会降低PD-1疗效，也不一定，此方面研究有待于进一步研究。

肠道微生物群的研究无疑给预测免疫治疗疗效打开了另一扇窗，如果将肠道微生物群与肿瘤基因组学组合到一起，可能会更加精准。（现在一个样本的16S测序从运输-抽提-建库-测序-分析整个流程下来，也就400RMB不到，如果你的一个样本16S测序要1000RMB甚至更高，那么...我也不知道说什么，只能说你有钱！）

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