多耐药肺炎克雷伯菌耐药基因的研究进展

本文将从耐药基因上阐述肺炎克雷伯菌的主要耐药机制，指导临床进行有效的抗感染治疗。

肺炎克雷伯菌属于革兰阴性菌中的肠杆菌科，可导致包括血流、肺部、肠道、中枢神经系统等全身多系统的感染。随着研究的深入，研究者们发现，肺炎克雷伯菌存在高毒力肺炎克雷伯菌（hvKP）和经典型肺炎克雷伯菌（cKP）两种亚型。其中，cKP又以对多种抗生素耐药为主要特征，耐药性降低了药物的有效性，并限制了患者的治疗选择，给临床抗感染治疗带来巨大挑战。

一、多耐药表型肺炎克雷伯菌的

相关定义

提到耐药，我们首先要回顾一下这几种常见的耐药表型：多耐药（MDR）、泛耐药（XDR）、全耐药（PDR）。

• MDR是指病原体对3类及3类以上抗菌药物同时耐药/不敏感，通常也称之为多重耐药。
• XDR是指除1-2类抗菌药物外，几乎对所有类别抗菌药物不敏感。
• PDR是指对目前临床应用的所有类别抗菌药物中的所有品种均不敏感。

此外，还可按照抗菌药物类型来划分耐药表型，根据临床重要性主要包括：

1.头孢抗生素类耐药表型（其中临床最为关注的为三代头孢类抗生素耐药表型）；2.碳青霉烯类抗生素耐药表型（是指针对如亚胺培南、美罗培南、厄他培南等抗生素耐药的表型）；3.黏菌素类抗生素耐药表型（多指多黏菌素）；4.喹诺酮类抗生素耐药表型（多指莫西沙星和左氧氟沙星）；5.替加环素类抗生素耐药表型。

需要引起重视的是，肺炎克雷伯菌近年来呈现快速上升的检出率。鉴于其具有较强获得外界基因元件的能力继而获取多耐药表型，世界卫生组织于2017年发布了首份急需新型抗菌药物的重点病原体清单，以期精准指导和加快促进新型抗菌药物的研究与开发。该名单共纳入12种不同细菌，分为三个层次，即极为迫切、十分迫切和中等重要，而对碳青霉烯类抗菌药物耐药和产超广谱β-内酰胺酶的肠杆菌科赫然在列，已经进入“极为迫切”的层次，说明其已经严重危害我国乃至世界公共卫生安全，是不可忽视的潜在病原体。

二、常见MDR表型肺炎克雷伯菌的

相关耐药分子基础

▌1.碳青霉烯酶（Carbapenemases）

碳青霉烯酶是一种可以水解青霉素、头孢菌素、碳青霉烯类等多种抗生素的β-内酰胺酶，即病原体经过水平或垂直传播获得的抵抗碳青霉烯类抗菌药物的能力。目前针对肺炎克雷伯菌而言，碳青霉烯酶耐药基因主要集中在Ambler分类的A、B和D类。

A类酶中以KPC型最常见，通常可水解几乎所有的β-内酰胺类药物和氨曲南，多见于肺炎克雷伯菌，由多种质粒介导快速传播；我国肺炎克雷伯菌主要流行的克隆株ST11绝大多数携带blaKPC-2基因；随着抗生素选择压力的增加，越来越多的肺炎克雷伯菌的KPC基因出现点突变，继而进一步引发Ω结构或相关蛋白结构的改变，呈现出对多种新型抗生素的耐药。但从目前流行病学来看，KPC-3似乎和KPC-2在国外均有较高的流行率，而我国仍以KPC-2为主要流行基因型。

B类酶主要为金属酶，包括NDM、IMP、VIM、SIM、GIM等。我国耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）主要携带前三种金属酶，欧美国家对上述几种金属酶均有较多报道。随着研究的逐渐深入，同时产A、B类酶的肺炎克雷伯菌亦已被报道，给临床抗感染治疗带来巨大挑战。
   

D类酶主要为OXA型，包括OXA-48、OXA-23、OXA-51等。上述OXA型耐药基因多集中在非发酵菌如鲍曼不动杆菌中；欧美国家报道了ST147型肺炎克雷伯菌产OXA-48，亦可同时产NDM亚型的金属酶，但流行病学调查显示，我国肺炎克雷伯菌携带OXA-48较少，不过仍需要注意监测。

▌2.超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）

ESBLs是由革兰阴性杆菌产生的最重要的一类β-内酰胺酶，也是使肺炎克雷伯菌呈现MDR表型最常见的一类酶。肺炎克雷伯菌天然携带的一类ESBLs是blaSHV-11，该基因常定位于肺炎克雷伯菌的染色体上，介导肺炎克雷伯菌对氨苄西林天然耐药。此后，越来越多的研究报道了SHV的点突变体，如SHV-5、SHV-12、SHV-13、SHV-14、SHV-16、SHV-18、SHV-27等SHV型ESBLs，介导多种β-内酰胺类抗生素耐药。

此外，TEM型ESBLs在肺炎克雷伯菌中也较为常见，目前已报道多种亚型，其中TEM-1D呈现主要流行趋势。另外一类比较常见的是blaCTX-M，其亦介导包含头孢菌素在内的多种β-内酰胺类抗生素的耐药，目前已经报道多种亚型，在临床实践中，blaCTX-M-15、blaCTX-M-17等在肺炎克雷伯菌中亦呈现流行趋势。此外，还有PER-2、VEB-1家族的ESBLs。这些突变酶的水解底物谱较广，能有效水解青霉素类、一至三代头孢菌素类和氨曲南，一部分甚至可以水解第四代头孢菌素类药物。

▌3.头孢菌素酶（AmpC）

AmpC酶是由革兰阴性杆菌产生的又一类重要的β-内酰胺酶。基因组流行病学研究发现，编码AmpC酶的基因主要位于肠杆菌科的染色体上，其可介导临床常见的广谱β-内酰胺类抗生素（三代头孢菌素、头霉素类等）耐药，并且不受临床常用的β-内酰胺酶抑制剂如克拉维酸、舒巴坦、三唑巴坦等抑制。该类耐药病原体的出现使得临床有效抗生素的选择更为困难。

▌4.外排泵

多由一系列基因簇编码形成，主动外排系统可识别一类或多类抗菌药物，在能量泵（多为ATP介导）的作用下，把进入细菌体内的抗菌药物“泵”出体外，其过度表达与细菌产生多重耐药性有关。同一种细菌体内可以携带多种外排泵，在抗生素选择压力下，选择性表达关键外排泵，从而在尽量不增加细菌适应性代价的同时实现抗菌药物的有效抵抗，使得病原体能在环境、宿主体内持久存留。

▌5.膜孔蛋白缺失

外膜孔蛋白缺失可降低病原体对多数抗生素的敏感性，其主要的作用机制是通过改变膜孔蛋白的通透性，从而禁止体外抗生素的进入，进而达到耐药的效果。简单来说，一旦外膜孔蛋白缺失或减少，就会造成抗生素进入细菌细胞内的量大大减少。这种耐药机制主要影响β-内酰胺类抗生素。目前有研究发现，可移动遗传元件插入孔蛋白相关基因簇可引发病原体的耐药出现。肺炎克雷伯菌多以携带OMPK36和OMPK35为主，在孔蛋白OMPK36和/或OMPK35降低或缺失（主要由可移动遗传元件介导）时，可介导多种抗生素的耐药。

值得注意的是，肺炎克雷伯菌对抗菌药物的耐药并非由以上单一因素造成。在临床实践中，MDR甚至XDR肺炎克雷伯菌往往携带多种耐药基因，不同的耐药基因可通过不同的耐药机制协同抵御外界抗菌药物的杀伤。此外，生物被膜的形成、持留菌的出现等都会使抗菌药物的杀伤效能大大降低。因此，加强肺炎克雷伯菌菌株的耐药性和基因组主动监测，不仅有利于抗菌药物的合理应用，亦能快速指导院感防控的快速反应。

三、从抗菌药物角度阐述耐药机制

▌1.喹诺酮类抗生素

临床上常用的喹诺酮类抗生素主要为莫西沙星和左氧氟沙星。病原体介导喹诺酮类抗菌药物耐药机制主要集中在抑制DNA 解旋酶和拓扑异构酶，从而干扰细菌DNA复制和转录的过程。点突变是常见的机制之一，尤其在肺炎克雷伯菌体内。基于全基因组测序数据发现，gyrA出现基因组突变后可使Ala67变为Gln106，gyrB编码的氨基酸Asp426可转变为Lys447，从而介导喹诺酮类抗菌药物耐药表型的出现。此外，还有拓扑异构酶的点突变（主要是parC和parE编码的C亚基和E亚基），亦可以引起喹诺酮类耐药的出现。

另外，耐药基因的水平转移加剧了喹诺酮类耐药表型的出现。qnr家族相关基因的发现，已被认为可介导肠杆菌科病原体获得喹诺酮类耐药表型；oqxAB最早被发现定位于质粒上，可在多种可移动元件介导下在肠杆菌科之间进行快速传播。这些机制可以相继或同时出现在肺炎克雷伯菌中，从而使得肺炎克雷伯菌呈现针对喹诺酮类抗菌药物的高水平耐药。

▌2.氨基糖苷类

氨基糖苷类抗菌药物问世时间较久远，在临床抗感染治疗中起到了巨大的作用。但随着对氨基糖苷类抗生素认识的增多，其肾毒性的副作用一直困扰临床医生，在一定时间内大大限制了该药物的临床应用。但随着氨基糖苷类抗生素相关衍生物的发现和基于大规模临床流行病学研究发现，氨基糖苷类抗生素在MDR肺炎克雷伯菌的抗感染治疗中具有重要的应用价值。

该类药物的耐药机制主要有2种：第一种是细菌能产生氨基糖苷修饰酶，钝化氨基糖苷类抗生素，导致耐药性产生；第二种是16SrRNA甲基化酶介导，阻止氨基糖苷有效结合到其位点。

▌3.磺胺类

磺胺类抗菌药物是通过干扰细菌内叶酸合成，从而达到抑菌目的。介导磺胺耐药表型的基因主要包括sul家族，其基因外环境较为复杂，包括质粒、转座子、整合子以及其他可移动遗传元件。但由于磺胺的肾毒性等副作用，使得该抗菌药物的应用较为局限，临床实践中亦较为谨慎，限制了磺胺类抗菌药物的广泛应用。

▌4.四环素类

四环素类药物主要包括米诺环素、多西环素、替加环素等药物，已广泛用于人医和畜牧业，具有广谱抗菌的作用。目前，介导四环素类抗生素耐药的基因主要集中在tet家族。

替加环素不同于米诺环素等常见的四环素类抗生素，其对革兰阴性菌和阳性菌均有较强的广谱抗菌作用，但耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌等病原体除外。近年来，新发现的tet（X）可介导替加环素的高水平耐药，并可在可移动遗传元件作用下快速地在不同菌种之间发生横向传播，给临床抗感染治疗带来了巨大挑战。此外，亦有相关报道发现tmex外排泵亦可以介导多种四环素类抗生素的耐药。

▌5.黏菌素

黏菌素是一种针对革兰阴性菌外膜脂多糖的多肽类抗菌药物，在一段时间内曾被广泛应用于兽医学。既往针对黏菌素的研究发现，其抗菌机制可能与编码革兰阴性菌的脂多糖（LPS）修饰酶的基因有关，主要包括pmrCAB家族，PhoPQ 双组分系统。此外，MgrB的突变、可移动遗传元件插入MgrB基因也是介导黏菌素耐药的主要因素。

黏菌素自问世以来，由于肾毒性等副作用，曾在一段时间内被大大限制了临床应用。但随着暴露的减少，大型流行病学调查发现，黏菌素对于耐碳青霉烯类肠杆菌科，尤其是肺炎克雷伯菌，具有较好的体外抗菌活性，是针对耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的潜在治疗手段之一。

上述针对黏菌素的耐药机制主要集中在垂直传播体系。在水平传播方面，我国学者首次发现了mcr基因是介导黏菌素耐药的关键基因，这一基因可在多种可移动遗传元件作用下在不同菌种和菌属之间进行快速传播。这一现象的发现使得抗生素的“最后一道防线”濒临崩溃。更为重要的是，mcr家族目前已经更新至了mcr-9变体，不仅在肺炎克雷伯菌中检出增加，亦在其他肠杆菌科中有了相关报道。因此，合理应用黏菌素对于应对MDR甚至XDR病原体时代的到来就显得极为重要。

四、MDR-hvKP的出现

随着研究的深入，越来越多的研究报道了MDR-hvKP的出现，给临床诊疗带来巨大挑战，严重威胁公共卫生安全。简单来说，MDR-hvKP的形成途径大体分为两大类：

• 第一，MDR-cKP获取外界重要毒力基因及其相关元件（比如质粒）继而呈现出高毒力多重耐药表型，这也是我国MDR-hvKP检出居多的主要原因；

• 第二，hvKP（多呈现多种抗菌药物敏感表型）获取多种耐药基因，从而进化成为MDR-hvKP，但通过此途径获取高毒力多耐药表型的情况似乎要远远低于第一种途径，可能受限于hvKP具有较厚的荚膜，阻止了其获取外界基因元件。
• 此外，领域内学者还报道了基于可移动遗传元件、质粒共获取等机制，进而进化成为MDR-hvKP的其他途径。

国内外的学者均报道了MDR-hvKP所致医院内感染及其高死亡率的情况。我国的MDR-hvKP主要以ST11型为主，已有多篇研究报道了ST11型MDR肺炎克雷伯菌引起的医院内感染暴发；ST11型MDR肺炎克雷伯菌亦可以在不同患者间的传播进化中，进一步获取耐药/毒力基因元件，成为高毒力多耐药株，使得临床面临无药可用的境况。因此，早期合理应用抗生素，积极的对肺炎克雷伯菌进行主动的基因组水平监测，并尽可能早期精准的施行院感防控的集束化措施，或许能遏制高毒力多耐药病原体的快速出现。

小结

综上所述，肺炎克雷伯菌较其他肠杆菌科、不动杆菌、假单胞菌具有较强的基因可塑性（即获取外界基因元件的能力强），其可在宿主内/宿主间进化中获取多种耐药/毒力基因元件，进而呈现高毒力多重耐药表型，可能对公共卫生造成重大挑战。因此，在临床实践中，我们需要不断优化抗生素的应用，加强主动监测并提早采取院感防控措施，为感染性疾病的诊治提供保障。

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来源于医学界急诊与重症频道

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