肺炎克雷伯菌的异质性耐药（译文）

肺炎克雷伯菌的异质性耐药

Abstract

Klebsiella pneumoniae is one of the most common pathogens responsible for infections, including pneumonia, urinary tract infections, and bacteremias. The increasing prevalence of multidrug-resistant K. pneumoniae was recognized in 2017 by the World Health Organization as a critical public health threat. Heteroresistance, defined as the presence of a subpopulation of cells with a higher MIC than the dominant population, is a frequent phenotype in many pathogens. Numerous reports on heteroresistant K. pneumoniae isolates have been published in the last few years. Heteroresistance is difficult to detect and study due to its phenotypic and genetic instability. Recent findings provide strong evidence that heteroresistance may be associated with an increased risk of recurrent infections and antibiotic treatment failure. This review focuses on antibiotic heteroresistance mechanisms in K. pneumoniae and potential therapeutic strategies against antibiotic heteroresistant isolates.

肺炎克雷伯菌为环境中常见的革兰氏阴性细菌，也是引起感染的最常见病原体之一，通常与酗酒者和糖尿病患者的社区获得性肺炎有关，可导致肺炎、尿路感染和菌血症等。肺炎克雷伯菌主要定植于健康人群的口咽、鼻咽和胃肠道的粘膜表面，对氨苄西林、羧苄青霉素和替卡西林天然耐药，然而，经典肺炎克雷伯菌（cKP）可通过获得染色体或移元件上（质粒和转座子）的抗性基因从而产生染色体青霉素酶（SHV-1）获得多重耐药性。多重耐药cKP是导致医院感染的主要原因之一，危重症和免疫功能低下患者常感染产ESBL和碳青霉烯酶的MDR cKP，这也是此类人群高死亡率的原因之一（40%-50%）。cKP不断积累抗性基因，从而产生广泛耐药（XDR）和泛耐药菌株（PDR），对现有所有可用抗菌药物均存在耐药性。近年来，高粘液表型的高毒性肺炎克雷伯菌（hvKP）呈现增长趋势，与cKP相比较而言，具有厚荚膜的hvKP对吞噬作用、补体和中性粒细胞介导的免疫反应抵抗性更强。有研究发现，hvKP可在巨噬细胞和中性粒细胞中存活，并以中性粒细胞为载体进行散播性感染。高侵袭性hvKP可感染健康和免疫低下人群并导致化脓性肝脓肿、眼内炎和脑膜炎等。MDR和XDRhvKP菌株接合质粒上的耐药基因和高毒力因子可不断发生融合，因而已严重威胁当下的公共健康安全。

异质性耐药是许多病原体中的常见表型，此类表型的菌株针对某种药物的MIC高于多数其他亚群。在过去几年内，全球范围内已出现多例异质性耐药肺炎克雷伯菌株，然而由于异质性耐药表型和遗传的不稳定性一直难以进行检测和研究。近来有研究表明，针对MDR/XDR/PDR肺炎克雷伯菌株的有效药物的缺乏并不是治疗失败的唯一原因，异质性耐药也可能导致肺炎克雷伯菌的复发性感染和抗生素治疗失败。本篇综述主要分析了肺炎克雷伯菌产生异质性耐药的机制。

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异质性耐药的定义及潜在机制

异质性耐药是多种病原菌的常见表型，可分为“多克隆”和“单克隆”。多克隆异质性耐药菌株指至少两种以上MIC不同的分离株组成的共感染模型或是在抗生素治疗期间出现稳定的耐药突变菌株，其中不同克隆株的耐药和易感表型均能稳定遗传。而单克隆异质性耐药菌株表现为任意亚群的暂时性耐药，维持几代后通常恢复易感性。最新关于异质性耐药的定义表明，耐药亚群应不影响主体菌群的生长，其MIC是药物最高浓度的八倍以上。除此之外，标准异质性耐药菌株在抗菌药物折点以上仍有较强生长能力。

然而，异质性耐药与另一种菌群持久性耐药不同，后者菌群在抗生素环境下中存在少数短暂耐药的休眠菌落，尽管不能进行复制，但在治疗结束后可以恢复生长（图1），从而导致复发性感染。

产生异质性耐药菌株最常见的机制是自发串联基因扩增，例如在多粘菌素异质性耐药鼠伤寒沙门氏菌分离株中可观察到prmD基因的扩增，后者促进脂质A修饰所需蛋白的合成。阿拉伯糖衍生物和磷酸乙醇胺可降低脂质A的净负电荷，通过强化外膜屏障（OM）导致多粘菌素耐药。编码氨基糖苷腺苷酸转移酶的aadB基因的广泛依赖RecA性扩增也可导致鲍曼不动杆菌对妥布霉素的不稳定耐药。也有学者发现，在芳基霉素异质性耐药大肠杆菌中可观察到编码芳基霉素靶信号肽lepB酶的LepB基因的扩增，拷贝数从1-50变化不等。此外，启动子突变也可能产生耐药基因，例如，有学者在亚胺培南异质性耐药鲍曼不动杆菌的β-内酰胺酶基因（blaADC）的启动子区域发现了插入序列（ISAba1）。同时，外排泵过表达和孔蛋白减少也可导致异质性耐药。例如，肠沙门氏菌中转录因子RamA上调可导致AcrAB-TolC和OqxAB外排泵过表达，从而形成菌株的替加环素异质性耐药。也有其他研究表明，OprD孔蛋白下调和外排系统过表达可导致铜绿假单胞菌对碳青霉烯和亚胺培南的异质性耐药。

异质性耐药的突变通常会提高菌株的适应性成本，因此在无抗生素条件下，细菌通常产生选择性突变而恢复敏感表型，而这种突变产生的敏感表型菌株尽管与野生易感分离株表型相似，但二者基因型并不相同。基因扩增的内在不稳定性也与异质性耐药的短暂性耐药的特征相符。

异质性耐药菌株在临床常被误认为敏感菌株，从而导致抗生素治疗时不仅不能治疗感染，反而促进了耐药突变株的产生。有研究表明，低于易感大肠杆菌和肠沙门氏菌临床分离株MIC水平的不同抗生素可导致耐药亚群富集和耐药基因拷贝数增加。

有学者发现，β-内酰胺可导致耐碳青霉烯大肠杆菌异质性的耐药亚群增多。此外，抗生素暴露和异质性耐药也可能有助于菌株逃避宿主免疫反应。有学者发现，异质性耐药阴沟肠杆菌分离株经粘菌素预处理可产生对宿主溶菌酶的交叉耐药，而敏感菌株并不会出现这一现象。也有研究表明，免疫缺乏小鼠阴沟肠杆菌感染模型的耐药亚群频率降低，这表明先天免疫反应可能促进耐药菌株的产生。除此之外，有研究表明，一些先天免疫反应相关成分（H2O2、溶菌酶、鼠类阳离子抗菌肽CRAMP及其人类直系同源物LL37）在体内外均可促进多粘菌素耐药亚群的产生。

异质性耐药肺炎克雷伯菌的流行和机制

肺炎克雷伯的异质性耐药相关描述如表1所述。

肺炎克雷伯菌的基因包括核心基因组（约2000个）和大量染色体和质粒中编码毒力因子和耐药基因的辅助基因（约3000-4000个）。基因的高变异性促进异质性耐药菌株的产生。

对多粘菌素的异质性耐药

肺炎克雷伯菌最常见的已知机制的异质性耐药表型为多粘菌素异质性耐药。（表1）临床常使用两种多粘菌素——粘菌素（多粘菌素E）和多粘菌素B。粘菌素在肺炎克雷伯感染的治疗中至关重要。多粘菌素靶向作用于革兰氏阴性细菌外膜脂多糖的脂质A部分，与Ca2+和Mg2+结合以破坏外膜完整性，使胞浆膜的渗透性增加，造成细菌内容物丢失从而裂解死亡。粘菌素产生耐药的机制有许多种，大多是使脂质A与阳离子、L-Ara4N和磷酸乙醇胺（PEtN）形成复合物，导致与带正电荷的多粘菌素结合减少，从而使得细菌逃避多粘菌素的杀菌作用。近来有研究表明，菌株也可由脂质A羟化和棕榈酰化样修饰产生粘菌素耐药性。阴离子的荚膜多糖可有助于多粘菌素与外膜表面结合，因而肺炎克雷伯荚膜突变体对多粘菌素具有较高的敏感性。

有研究发现，粘菌素耐药菌株的PhoP蛋白中含有单个氨基酸突变（Asp191Tyr）。phoP/Q 是革兰阴性菌中普遍存在的双组分调控系统。（图2）。当细菌环境变化时（低pH、低Mg2+ 浓度和抗菌肽暴露等），phoP/Q系统被激活并调节细菌外膜蛋白以及LPS结构。粘菌素异质性耐药肺炎克雷伯菌中，PhoP突变合成L-Ara4N的操纵子pmrHFIJKLM（也称arnBCADTEF或pbgPE）过表达。多粘菌素耐药菌株向敏感菌株这一逆向突变则与phoP基因部分缺失导致的PhoP失活有关。

PhoPQ系统在粘菌素异质性耐药中的作用在不同研究中均能得到证实，有学者表明，PhoQ的氨基酸突变或过表达可能导致PhoP磷酸化并激活修饰脂质A的基因。粘菌素异质性耐药肺炎克雷伯菌也可能由PmrAB基因的突变导致，该基因编码另一个调控L-Ara4N和PEtN合成的双组分系统。不同耐药亚群中可以检测到PhoPQ和 PmrAB的不同氨基酸突变产物。此外，crrB基因突变也可能导致肺炎克雷伯菌的不稳定粘菌素异质性耐药。CrrAB双组分系统参与调控pmrHFIJKLM操纵子，ccrB突变可促进脂质A与L-Ara4N和pEtN结合从而诱导多耐粘菌素耐药性产生。除此之外，粘菌素耐药性也可能与mgrB、yciM和lpxM基因的突变、插入或缺失有关。mgrB 基因编码的跨膜蛋白可以负调节PhoPQ系统，因此，它的失活可导致pmrHFIJKLM 操纵子的过表达。mgrB基因失活也能使细菌产生厚荚膜以产生粘菌素耐药。根据统计，点突变、插入或缺失导致的mgrB失活是肺炎克雷伯菌感染的患者使用多粘菌素治疗时最常见的耐药机制之一。yciM和lpxM基因可能通过调节LPS合成和脂质乙酰化从而导致耐药。

除了基因突变的机制外，肺炎克雷伯菌生物膜的菌落表型变异也可能导致粘菌素异质性耐药。细菌生物膜是细菌分泌物将其自身包绕其中而形成的大量细菌聚集膜样物，是抗生素和其他压力因素的物理屏障，其复杂结构有助于异质性耐药菌群的产生。生物膜内氧气和营养物质有限，可能会抑制细菌在压力条件下的新陈代谢和生长。

对碳青霉烯类的异质性耐药

肺炎克雷伯菌对β-内酰胺类耐药的主要机制是产ESBLs、AmpC-β-内酰胺酶（DHA、FOX）和碳青霉烯酶。质粒介导的ESBL属于CTX-M、SHV和TEM家族，可水解第三代头孢菌素和氨曲南。肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶 (KPC) 是最常见的A类丝氨酸 β-内酰胺酶，由质粒介导的blaKPC基因编码，并介由Tn4401转座子转运而在菌群中转移。近来，位于移动遗传元件上的KPC突变体不断增多，并在革兰氏阴性菌中广泛传播。除了KPC，肺炎克雷伯菌也可产生不同的金属-β-内酰胺酶，包括新德里金属-β-内酰胺酶 (NDM)、维罗纳整合子编码的金属-b-内酰胺酶 (VIM)、亚胺培南酶 (IMP)和OXA- 48样碳青霉烯酶。其中，产NDM肺炎克雷伯菌由于其多重耐药性和广泛传播性引起了人们的极大关注。多项研究表明，肺炎克雷伯菌逐渐增强的β-内酰胺耐药性可能与外膜孔蛋白OmpK35和OmpK36的缺失或突变有关。OmpK35和OmpK36相比其大肠杆菌同源物OmpF和OmpC渗透力更强，因此肺炎克雷伯菌对第三代头孢菌素更敏感。而孔蛋白减少可抑制β-内酰胺的摄入，结合esbls的共同作用使菌株耐药。例如，有学者发现了一例由OmpK36孔蛋白减少所导致的产KPC-2肺炎克雷伯菌菌株，相比于敏感菌株而言，其对亚胺培南的MIC增加了32倍。一些分离株在亚胺培南作用下可发生孔蛋白下调，后可在无药物环境下恢复孔蛋白水平而发展为异质性耐药菌株，然而大多数分离株表现为不可逆OmpK36丢失并保持高水平亚胺培南耐药。此外，有研究表明，blaKPC-2一过性过表达可导致肺炎克雷伯菌产生美罗培南异质性耐药，而后在无美罗培南培养基上生长可恢复药物敏感性。

四环素异质性耐药

革兰氏阴性细菌产生四环素耐药的主要机制为药物外排和核糖体保护。临床常使用四环素衍生物——半合成替加环素和全合成依拉环素治疗四环素耐药肺炎克雷伯菌。然而近年来，替加环素和依拉环素耐药的肺炎克雷伯菌不断增多。据研究，外排泵AcrAB、OqxAB和MacAB的过表达可导致菌株四环素耐药。AcrAB和oqxAB的表达受转录激活子的调节，如RamA、SoxS和MarA（分别受转录抑制因子RamR、SoxR和MarR调控）。此外，突变核糖体蛋白S10（rpsJ基因编码）可抑制抗生素与30S核糖体小亚基的结合，从而导致替加环素和依拉环素耐药性。

截止到现在，有三例替加环素和依拉环素的异质性耐药菌株。（表1）主要有以下几种机制：①acrAB外排泵基因的过表达。②ramR突变引起RamA上调，产生AcrAB-TolC外排泵。③soxR基因突变导致SoxS的过表达和AcrAB-TolC上调。④编码核糖体S10蛋白的rpsJ发生插入和移码突变，从而抑制替加环素与16S RNA结合。也有其他研究表明，依拉环素异质性耐药可由OqxAB和MacAB外排泵以及转录调节剂RamA的过表达引起。

氨基糖苷异质性耐药

肺炎克雷伯菌和其他肠杆菌产生氨基糖苷类耐药主要由氨基糖苷类修饰酶(AME)和16S核糖体RNA甲基转移酶（armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、rmtE 和 npmA）引起。AME包括N-乙酰转移酶、O-核苷酸转移酶和O-磷酸转移酶，共价修饰氨基糖苷上的特定氨基或羟基部分。

肺炎克雷伯菌的氨基糖苷类异质性耐药主要由位于质粒上的AMEs基因扩增导致，此类基因编码氨基糖苷类乙酰转移酶（aac）。质粒的拷贝数在庆大霉素、妥布霉素或奈替米星作用下增加而导致耐药。然而这种耐药表型并不稳定，无抗生素传代40代后，菌株可减少拷贝数或丢失质粒而恢复敏感。有学者在阿米卡星耐药亚群中观察到ubiJ和cydA基因突变，可能导致小菌落变异表型而对氨基糖苷类耐药，而在无阿米卡星环境下，菌株发生补偿性点突变或重复（ubiJ），从而恢复对阿米卡星的敏感性。acc基因扩增导致的阿米卡星耐药突变增加了菌株的适应性成本，因而菌株在无选择压力时可恢复氨基糖苷类药物敏感性。此外，有学者发现，阿米卡星异质性耐药可能与aac基因的不稳定过表达和一些编码参与各种生理过程（碳水化合物摄取和染色体分离）的蛋白质的基因中的几个突变（SNV）有关。

讨论

1、异质性耐药可能是导致治疗失败和反复感染的重要原因，而使用相同抗生素反复治疗异质性耐药菌株复发感染可能导致耐药菌株发生突变进化。异质性耐药的产生机制包括脂质A修饰、外排泵系统的过表达、基因扩增等。尽管已知拥有生物膜的异质性耐药菌株相对于浮游细菌的耐药性更强，但生物膜对于异质性耐药的影响尚不清楚。

2、大多数关于异质性耐药的研究均采用体外试验或动物模型，因此不能完全符合宿主生物体的复杂机制，例如病原体和宿主免疫反应之间相互作用、不同异质性耐药亚群共存反应等（包括难以检测的持久细菌，VBNC细菌）。

3、COIVD-19流行期间，肺炎克雷伯菌和其他ESKAPE病原体的传播受到一定限制。然而，消毒剂的广泛使用和抗生素的使用增加可能反而促进细菌耐药性的产生和传播。多项研究表明，COVID-19患者可有50%以上合并感染碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌，而后者对医院使用最广泛的消毒剂氯已定具存在异质性耐药。

4、鉴于当下对于异质性耐药的检测仍存在困难，进一步研究肺炎克雷伯菌异质性耐药的机制并防止其多重耐药性的传播至关重要。

文献来源：Antibiotic Heteroresistance in Klebsiella pneumoniae. Int J Mol Sci. 2021 Dec 31;23(1):449. doi: 10.3390/ijms23010449. 德安实验诊断.李辰雨译

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