CAR-T开发持续火热，生产工艺的优化进一步释放其应用潜力丨医麦新观察

点击阅读原文，免费报名参会

本文由医麦客原创，欢迎分享，转载须授权

2020年10月6日/医麦客新闻 eMedClub News/--免疫疗法已经成为现代癌症治疗越来越重要的支柱，尤其是免疫检查点抑制剂和过继性细胞疗法（ACT），其中ACT包括肿瘤浸润淋巴细胞（TIL），T细胞受体（TCR）修饰的T细胞和嵌合抗原受体（CAR）T细胞，代表了癌症创新治疗策略中的里程碑。

但ACT显示出局限性，因为TILs疗法仅在特定的高度免疫原性癌症（例如恶性黑色素瘤）中取得了令人鼓舞的结果。依赖于人类白细胞抗原（HLA）的抗原识别限制了TCR修饰的T细胞的应用，HLA表达的下调可导致肿瘤逃逸， 而CAR-T细胞将T细胞的动力学（ dynamic）与抗体的抗原特异性结合在一起，它们可以在不进行抗原处理的情况下结合肿瘤抗原，而与HLA介导的抗原呈递无关。

靶向CD19的CAR-T细胞疗法已经在B细胞恶性肿瘤中取得了突出的临床效果，目前，美国FDA已经批准了3款自体CAR-T产品上市，它们都靶向CD19 ；另外国内的CAR-T领域今年也步入了上市阶段。而进入针对其他肿瘤抗原靶标（例如BCMA）的CAR-T细胞，以及包括“现货”CAR-T在内的多种创新CAR-T策略也正在如火如荼的开发中。

从全球细胞疗法的开发来看，CAR-T细胞是持续占据主要位置。2019年，CAR-T细胞疗法在全球范围内1011款已获批或正在研发的细胞疗法中占比超过了五成，共有568款，超过了剩余疗法（譬如TCR-T细胞疗法，TIL疗法等）类型的总和。根据2020年NRDD上发表的最新数据，全球癌症细胞疗法管线中CAR-T细胞疗法的增长数目仍是最多，2020年比2019年增长了290款，涨幅为51%，2019年较2018年增长164款，涨幅为40%。与此同时，也有越来越多的CAR-T项目进入临床开发，截止2020年3月31日，所有癌症细胞疗法的临床试验数目中，CAR-T细胞遥遥领先，达1041项。

但尽管目前CAR-T领域进展喜人，行业仍然面临着诸多未被攻破的挑战，如抗肿瘤的有效性和持久性；在实体瘤中应用的局限性；以及随着越来越多候选产品的临床推进，符合临床和商业规范的大规模生产制造等问题，限制了这一极具潜力的治疗方法的进一步发展。

CAR-T细胞的细胞组成和免疫表型对治疗的成功起关键作用。最终细胞产物的组成不仅受CAR-T细胞结构的影响，而且还受离体T细胞体外扩增过程中的培养条件的影响，这包括不同的T细胞激活策略，细胞因子补充和针对分化阻滞的特异性途径抑制。而目前，CAR-T细胞的制造过程和工艺还没有标准化，优化整个流程中的生产工艺，对于改善其治疗疗效以充分利用这种现代抗癌疗法的潜力和推进其产业转化至关重要。

不同T细胞亚型和亚群影响CAR-T的有效治疗

在早期的CAR-T细胞治疗中，输注的CAR-T细胞数量是决定治疗成功与否的主要因素。然而，超过一定的阈值，输注的CAR-T细胞的绝对数量与体内扩张和治疗成功没有直接关系。因此，除了输注的CAR-T细胞的绝对数量之外，其他因素可能对CAR-T细胞的疗效更为重要。例如，过继转移的T细胞的细胞组成和表型，包括T细胞亚型和亚群，被认为是有效免疫治疗最关键的成功因素之一。

虽然，尤其是细胞毒性CD8+ CAR-T细胞，可直接介导肿瘤细胞的根除，但CD4+T辅助细胞（Th细胞）也被鉴定是一种非常有效和重要的T细胞亚群。CD4+ CAR-T细胞具有与CD8+ CAR-T细胞相当的细胞毒性；另外，CD4+Th细胞和CD8+T细胞的平衡比例可以对肿瘤的根除产生积极的影响。

据报道，CD4+: CD8+ 比值为1:1的CAR-T细胞治疗B-ALL可获得较高的缓解率；例如，BMS从Celgene收购的抗CD19 CAR-T细胞产品liscaptagene maraluel（liso cel；JCAR017），就以特定比例（1:1）的CD4+Th-CAR-T细胞和细胞毒性CD8+CAR-T细胞给药。必须在生产开始时就分离这些细胞亚群，并分别进行修饰，以获得特定的CD4：CD8比例，从而进入更复杂的制造过程。

不同的Th细胞亚群起着重要作用。TEff细胞（T effector-like cells ）与调节性T（Treg）细胞之间的平衡也影响着过继免疫治疗的成功。CD4+Treg细胞浸润实体瘤可降低CD28-CD3ζ信号转导CAR-T细胞的抗肿瘤活性。在存在Treg细胞的情况下，CD28-CD3ζ信号转导CAR的CD28 CAR内结构域中Lck结合部分的缺失可以增强抗肿瘤功效。据报道，具有诱导性T细胞共刺激因子（ICOS）胞内信号转导域的CAR-T细胞能稳定Th17细胞功能，提高CAR-T细胞在体内的存活率。此外，与基于4-1BB的CAR-T细胞相比，具有ICOS和4-1BB细胞内信号转导域的CAR-T细胞在实体瘤中的疗效更高。

除了T细胞亚型外，CAR-T细胞的分化状态对治疗成功也起着至关重要的作用。分离的和体外扩增的T细胞提供了在细胞免疫治疗中必须考虑的固有特性。由于T细胞的分化状态不同，健康献血者和患者的外周血（PB）中T细胞的效应功能、表型特征以及外观都各不相同，这取决于年龄、先前的抗原暴露以及应用的细胞毒性疗法。

在ACT中，终末分化的CD45RA+ CCR7- TEff 细胞在体外表现出增强的抗肿瘤活性，而在体内T细胞的活化、增殖能力和持久性受到损害。这些发现改变了为ACT选择特定T细胞亚群的方法和标准，并将重点放在分化程度较低的T细胞上：定义为CD45RA+CD45RO−CD95−T细胞的初始样T细胞（TN cells）表达淋巴结归巢标志物CCR7和CD62L，以及CD28和CD27。相反，CD45RA- CD45RO + CD95 +记忆T细胞可以分为CD62L + CCR7 + T中央记忆样细胞（TCMcells）和CD62L- CCR7- T效应记忆样细胞（TEM cells）。

干细胞记忆样T细胞（TSCM cells）代表最近描述的T细胞亚群，类似于TN细胞，它们是CD45RA + CD45RO-CCR7 +，并且表达记忆相关标记，例如CD95，从而表现出干细胞的特性，包括高增殖性和自我更新能力。TN细胞和TSCM细胞在给药后有能力在体内长期存活和增殖，它们可能导致临床结果的改善。尤其是，在所有记忆型和效应型亚群中的自我更新和分化能力使TSCM细胞能够通过提供更多分化的TEM细胞和TEff细胞进行免疫攻击，以及用新的低分化TSCM细胞和TCM细胞来更新T细胞库，从而维持持久的抗肿瘤活性。

因此，输注大量低分化的CAR-T细胞有利于治疗的成功。单个T细胞亚群的潜力已经有文献进行了详细的描述。然而，关于在生产过程中如何在最终的CAR-T细胞产物中形成更有利的细胞组成和T细胞表型的描述却很少。

CAR-T细胞上的耗竭表达和归巢标记

抑制性肿瘤微环境结合抑制性受体，如PD-1、CTLA-4、LAG-3和TIM-3，也可能导致某些肿瘤组织中CAR-T细胞反应率不足，从而削弱免疫攻击。CD8+T细胞上耗竭相关抑制受体PD-1和TIM-3的高表达与T细胞功能受损有关。肿瘤特异性T细胞的功能障碍是一个导致抗原驱动分化的动态过程，在肿瘤发生的早期阶段就开始了。

转录组学分析显示，在获得完全缓解的CLL患者的CAR-T细胞中，记忆相关基因表达丰富。相反，对无反应者的CAR-T细胞的分析表明，介导T细胞分化的基因、糖酵解基因，衰竭和凋亡的基因上调。

此外，没有PD-1表达的分化程度较低的CD8 + CAR-T细胞群体在肿瘤控制中起着至关重要的作用。另外，在对CD19 CAR-T细胞治疗有反应的淋巴瘤患者中观察到PD-L1、PD-1、LAG-3和TIM-3低表达。而无应答者，肿瘤细胞上的免疫检查点配体和免疫细胞上的免疫检查点受体有较高水平的表达。

通过将靶抗原转移至T细胞，CAR-T细胞可通过吞噬作用引起可逆的抗原损失，从而导致癌细胞上靶标密度降低。此外，通过促进耗竭和fratricide T细胞杀伤，T细胞活性降低。据报道，编码单一ITAM的CAR-T细胞显示高功能CART细胞的持久性得到改善。导致抑制性T细胞受体与其在癌细胞上表达的配体之间相互作用破坏的策略可能会改善基于细胞的疗法的治疗效果。应用PD-1阻断抗体可提高CAR-T细胞的治疗效果。此外，据报道，在临床前模型中，与传统的CAR-T细胞相比，产生抗PD-1单链可变片段（scFv）的CART细胞具有强大的治疗作用。尽管这些策略旨在在患者给药后优化体内CAR-T细胞治疗，但改善耗竭状态，尤其是在制造过程中减少CAR-T细胞上抑制性受体表达的其他策略也是非常必要的。

另一个挑战是改善CAR-T细胞对肿瘤部位的浸润。T细胞归巢是多分子相互作用的结果。肿瘤部位CAR-T细胞抗肿瘤免疫反应的抑制可能是通过免疫屏障介导的。不同的归巢特性构成了不同T细胞亚群的另一个显著特征。TN细胞、TSCM细胞和TCM细胞倾向于迁移到淋巴组织中，TEM细胞和TEff细胞则倾向于外周组织。淋巴细胞归巢标记物CD62L和CCR7在低分化T细胞上的表达增强与ACT在临床前模型中抗肿瘤活性的增强有关，可能对CAR-T细胞有益。

T细胞外渗，归巢和在肿瘤微环境中的持久性是克服目前CAR-T细胞治疗实体肿瘤的局限性的重要方面。CD28共刺激可降低转化生长因子β（TGFβ）介导的T细胞增殖抑制作用。CXCR2的过度表达可以促进T细胞向肿瘤部位的迁移。CCR2b在间皮素特异性CAR-T细胞和GD2特异性CART细胞上的过度表达导致T细胞肿瘤浸润增强。据报道，在异种移植模型中，表达CCR4的CD30特异性CAR-T细胞可介导增强的肿瘤控制。NKG2D特异性CAR-T细胞可在肿瘤部位以CXCR3依赖的方式募集和激活内源性抗原特异性细胞毒CD8+细胞和CD4+Th细胞，从而提高肿瘤的根除率。CAR-T细胞上特异性归巢标志物表达的调节和作用还有待进一步研究。

CAR-T细胞制造工艺的优化

CAR-T细胞制造过程的主要方面是相对标准化的，而在每个制造步骤中都可以发现明显的差异。

▲当前CAR-T细胞疗法的原理（图片来源：参考来源1）

CAR-T细胞生产过程包括最初分离和富集T细胞、制备CAR-T细胞（包括T细胞活化、T细胞扩增、使用病毒或非病毒载体系统进行CAR基因转移），然后进行体外CAR-T细胞扩增。最终的细胞产品要经过最后的末端工艺和冷冻保存。质量控制测试在生产过程中进行，并对最终的冻存CAR-T细胞产品进行完整性测试。癌症患者通常在使用最终批准的CAR-T细胞产品之前接受淋巴清除治疗。

T细胞的分离和富集

传统方法Ficoll密度梯度离心用于去除颗粒细胞、红细胞和血小板；促进或将生产步骤合并到一个系统中自动化的分离系统也已经被开发，例如用于分离、收获和细胞产品最终配方的Sefia Cell Processing System，或用于各种细胞类型的自动化GMP兼容制造CliniMACS Prodigy®系统。

生产过程开始时的细胞组成会影响CAR-T细胞的表型，例如，在PB中有大量循环肿瘤细胞的患者中可能需要选择CD3 + T细胞。这种基于CD3+进行的细胞分选，可以磁珠为基础的技术如CliniMACS 系统，使用anti-CD3，anti-CD4，anti-CD8磁珠分选或者去除特定的细胞群，以获得合理比例的CD4：CD8。另外，特定未分化的TN，TSCM，TCM细胞对于临床是有益的，但是分选流程复杂，在实际生产流程中有一定困难。

T细胞活化

T细胞活化是CAR-T细胞生产必不可少的步骤。最佳激活应导致足够的T细胞扩增，而不会引起巨大的T细胞分化或激活诱导的细胞死亡（AICD）。抗原呈递细胞（APC），例如树突状细胞（DC），介导生理性T细胞活化。DC伴随着困难的实验室和临床应用，因此DC对于CAR-T细胞疗法不切实际。为了避免将APC用作离体T细胞活化的内源性活化剂，已经开发了简化的活化策略。

anti-CD3/anti-CD28抗体活化：使用抗CD3（OKT-3单克隆抗体）/抗CD28抗体包被磁珠作为人工抗原呈递颗粒，anti-CD3提供增殖信号，anti-CD28提供共刺激信号，活化之后，磁珠可被去除掉。和可溶性OKT-3抗体相比，抗体包被磁珠活化细胞，具有更少的分化，更少衰老的特点，另外富集和清洗细胞会更加简单，昂贵抗体的丢失更少。因此，抗CD3/抗CD28抗体包被磁珠被认为是更有前途的活化策略，如Kymriah和liso-cel (JCAR017)都是采用的这一策略。

另外，一种特殊的聚合物纳米基质产品(T Cell TransAct™)与人源化CD3和CD28抗体结合，一起使用无血清培养基 (T exMACS™)培养，也可用于T细胞活化。这种方法使高表达CD62L、CCR7的 TCM细胞增多，IL-2的生成增加，减少CD57+耗竭T细胞，但是不改变PD-1的表达和基因转染效率，而且使细胞裂解活性降低。

Retronectin：使用重组人纤连蛋白片段，主要已知其可以增加逆转录病毒的基因转导效率，用作T细胞活化剂的情况鲜为人知。Retronectin和板结合的抗CD3抗体，或者抗CD3/抗CD28抗体，用于GD2特异性CAR-T和CD19特异性CAR-T，可以增加TN和TSCM的表型；其与抗CD3抗体或抗CD3 /抗CD28抗体包被的磁珠一起用于工程化表达AcGFP的T细胞，也有类似的T细胞活化效果。但Retronectin介导的T细胞活化主要缺点在于T细胞活化弱、扩增不足、基因转移效率降低、细胞因子分泌减少。

人工APC细胞：递呈肿瘤相关抗原（TAA）的non-viable人工APC，以CAR依赖的方式活化T细胞。这些人工APC仅刺激TAA特异性CAR-T细胞。

基因转导系统

非病毒或病毒载体将相应的遗传信息转移到T细胞中,介导T细胞表面的CAR表达。基于质粒的转座子/转座酶系统和病毒载体（包括γ-逆转录病毒和慢病毒载体）以及基因组编辑和裸DNA的电穿孔被用于CAR-T细胞中的基因传递。

病毒载体：目前，诺华的Kymriah和 BMS的liso-cel（JCAR017）)均使用慢病毒载体。Kite的Yescarta使用的逆转录病毒。

病毒载体具有较高的基因转移效率，并可以产生安全的产品。逆转录病毒生产需要稳定的包装细胞，而慢病毒载体生产需要大量质粒DNA进行瞬时转染，另外病毒的生产需要GMP级别的生产车间和一系列的检测方法，其生产成本和工艺是目前行业的最大瓶颈之一。

基于质粒的基因传递：转座子/转座酶系统是非病毒CAR基因传递的替代策略。代表系统包括“Sleeping Beauty”转座子/转座酶系统，其由两个DNA质粒组成，一个质粒包含编码CAR基因的转座子，另一个质粒表达转座酶（这是切除和插入转基因所必需的）。目前已经有基于这一策略的CAR-T产品进入临床试验阶段。

这种基于质粒的基因传递用于CAR-T细胞，由于无需生产GMP级别的病毒，具有成本低的优势。质粒电穿孔主要在第一代CAR-T和第三代CAR-T中被使用。

基因编辑：基因组工程工具，特别是基于CRISPR/Cas9的基因编辑，代表了基于CAR的疗法的发展领域，可对人类细胞进行有效的序列特异性干预。

CRISPR/Cas9系统结合AAV载体，将编码CAR的DNA整合入TRAC基因座中，使CAR均匀表达，提高T细胞效力，抑制T细胞分化和衰竭。此外，CRISPR/Cas9基因编辑和慢病毒转导用于产生PD-1缺陷的CD19特异性CAR-T，增强抗肿瘤活性。

CAR结构

CARs模块化设计有四个主要组件，分别是抗原结合域、铰链（Hinge）、跨膜结构域和胞内信号结构域。每一种组件都有其独特的功能，而CAR的最佳分子设计可以通过蛋白质结构域的多样化来实现，其最佳组成对基于CAR-T细胞的癌症免疫治疗是至关重要的。

▲CAR结构（图片来源：参考来源2）

目前，CAR-T细胞疗法已经发展至第四代CAR，第一代CAR的胞内结构域中只有信号转导结构域，没有共刺激域，CAR-T细胞活性差，体内存活时间短，第二代和第三代CAR分别引入了一个和两个共刺激分子，第四代CAR则还引入了促炎症细胞因子。

▲4代CAR（图片来源：参考来源1）

已上市的CAR-T产品中，Kymriah（诺华）、Yescarta（吉利德/Kite）都是二代CAR，Kymriah中用的是4-1BB共刺激域，Yescarta使用的CD28共刺激域，据悉，此前刚上市的Tecartus（吉利德/Kite）与Yescarta具有相同的CAR结构。

CAR设计超越传统结构的进展将是解决目前限制并将CAR-T细胞的使用扩展到更广泛的恶性肿瘤中所必需的，例如全人源化CAR-T、同种异体CAR-T设计、可调控CAR活性的设计等。

T细胞扩增

在CAR-T细胞扩增期间，细胞数量不断增加，这要求更多或更大的组织培养瓶或培养皿， 极大地使制造过程复杂化，并且难以实现大规模生产。 

因此，已经开发了静态培养袋，其允许较少的手动打开处理，管道连接可以使其在无菌条件下进行 。 另一种替代方法是摇摆生物反应器，例如Xuri™ Cell Expansion System 和 WAVETM Bioreactor System，它们利用灌注方案添加营养素并去除生长抑制物质，从而简化了制造过程。

细胞因子刺激：在CAR-T细胞生产工艺中使用细胞因子作为刺激信号，是影响最终CAR-T细胞产品的组成、质量和表型的另一个因素。主要补充的是γ链细胞因子：IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-21，用于CAR-T细胞生产的两种最常用策略是基于IL-2或IL-7，其同时使用或不使用IL-15。例如，IL-2被补充用于Yescarta的生产。

目前的研究主要依赖于IL-2，IL-7，IL-15和IL-21。最佳的细胞因子组成以及其他细胞因子在CAR-T细胞生成中的作用尚不明确。

抑制特定的信号通路：在离体T细胞扩增过程中补充通路抑制剂可能会通过抑制特异性信号传导途径而中断T细胞分化，从而使最终CAR-T细胞产物中的T细胞表型向分化程度较低的表型转移。可能的靶标包括用于特定通路抑制的GSK3β，mTOR，AKT和PI3K。

▲抑制T细胞分化过程的信号传导途径（图片来源：参考来源1）

冷冻保存

在大多数目前应用的CAR-T细胞治疗方法中，在生产结束时对CAR-T细胞进行低温保存是质量控制测试的强制要求，它可以使最终产品从生产地点运输到临床中心。此外，产品的管理会更加灵活，患者可能会接受多种CART细胞治疗。据报道，冷冻保存CAR-T细胞长达90天并不影响细胞的活力。使用前37℃过夜，可以恢复其细胞活力，另外，在输血前立即解冻低温保存CAR-T细胞，在体内的持久性和功效与新鲜CAR-T细胞相似。

总之，冷冻保存是常规应用的生产步骤，显然不会明显损害CAR-T细胞产品。

继2020 BPIT 生物药创新技术大会在南京举办之后，承接生物创新药产业转化的姊妹会议的2020 BPID生物药产业发展大会将于2020年11月2日-3日在苏州凯宾斯基酒店拉开帷幕。

大会聚焦抗体药物、细胞与基因治疗、预防和治疗性疫苗、干细胞再生医学等热门生物医药领域，满足参会者在产业化过程中对临床前药效毒理、临床试验和商业化生产以及产业落地、投融资的全方位需求。感兴趣的小伙伴赶紧报名参加吧！

点击上图查看大会日程

点击文末【阅读原文】注册报名

招商合作：

电话：[phone]（参展）

电话：[phone]（参会）

邮箱：[e-mail](资料回执)

参考资料：

1.doi:10.3390/ijms20246223 

2.https://www.nature.com/articles/s41571-019-0297-y

医麦客近期热门报道

点击“阅读原文”，注册报名！