精彩回顾丨高效转导技术联合新型基因编辑助力细胞与基因治疗经验分享

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2021年7月8日/医麦客新闻 eMedClub News/--医麦课堂将携手Integrated DNA Technologies(埃德特生物，以下简称IDT)和Lonza上线一场主题为“高效转导技术联合新型基因编辑助力细胞与基因治疗经验分享”的线上直播课。

本期课堂中，上海南方模式生物科技副总经理孙瑞林博士、埃德特（上海）生物科技有限公司应用经理王丙寅博士、Lonza应用科学家马顺为线上观众带来了精彩报告。

孙瑞林博士为大家带来了《CRISPR/Cas9电转系统在小鼠胚胎干细胞基因修饰中的高效应用》主题讲座，讲座内容主要包括：

☑ 小鼠胚胎干细胞打靶和CRISPR技术制备基因修饰小鼠模型的简要介绍；

☑ 两种方法存在的问题；

☑ CRISPR/CAS9电转系统在小鼠胚胎干细胞基因修饰中的应用比较。

王丙寅博士为大家带来了《创新驱动的基因编辑一站式解决方案——IDT Alt-R CRISPR基因编辑系统》主题讲座，讲座内容主要包括：

☑ 性能优化后的引导RNA让基因编辑实验简便无忧；

☑ CRISPR核酸内切酶的功能拓展实现基因编辑的高效精准；

☑ 高效同源介导重组为基因敲入实验保驾护航。

马顺为大家带来了《利用Nucleofector™技术实现基于CRISPR的基因组编辑》主题讲座，讲座内容主要包括：

☑ 高效的非病毒介导的Nucleofector™技术；

☑ Nucleofector™技与CRISPR基因编辑技术的结合；

☑ 大体积全封闭的转染方式满足临床生产的需求。

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CRISPR/CAS9电转系统的阳性率会更高

在当下的生命科学实验中，常常用到特定的小鼠模型。而一般通过基因工程对小鼠进行修饰得到所需的模型，通常来说，我们制备小鼠模型常用的基因修饰技术应用比较广泛的是小鼠胚胎干细胞打靶和CRISPR技术。

孙瑞林博士为我们详细介绍了小鼠胚胎干细胞打靶和CRISPR技术的发展过程和具体应用流程。同时，孙瑞林博士也分享了这两种技术所存在的一些局限性问题。

小鼠胚胎干细胞打靶技术具有较长的发展历史，应用也比较成熟，可以从ES细胞层面筛选，可以进行多次的修饰改造。但是ES细胞打靶技术仍然存在一定的问题，例如常规方法ES细胞层面重组效率低、ES细胞的全能性维持及基因组不稳定性。

CRISPR系统大大改变了基因修饰模型的建立方法。基于CRISPR/CAS9的受精卵注射技术具有效率高、直接注射受精卵制备简单、制备步骤少、周期长，对仪器设备和技术水平要求较低的优点，但是也存在一定的局限性，例如大片段的重组效率仍然较低、多点位的敲入效率很低、潜在的脱靶问题等。

随后孙瑞林博士以多个案例为大家讲解了CRISPR/CAS9显著提高了小鼠胚胎干细胞中的基因修饰效率。同时，从效率和风险层面出发，孙瑞林博士为我们分享了在不同的具体应用（包括基因敲除、基因点突变、条件敲除、基因敲入和基因人源化）该使用哪一种技术和转染方式，并对比了脂质体、mRNA和电转三种转染方式的阳性率。更多详情，扫描下方二维码，进入课程回放。

总的来说，电转系统可以取得较好的阳性率，同时也可以避免转染试剂对细胞的毒性。最后，孙瑞林博士分享了基于CRISPR/CAS9电转系统的小鼠胚胎干细胞基因修饰应用，以具体的案例提示，电转系统可以在小鼠胚胎干细胞中实现高效的基因修饰。

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实现CRISPR系统高效且精确编辑

CRISPR技术是近几年来最重要的研究进展，CRISPR基因编辑系统由非特异性核酸内切酶和引导RNA组成。王丙寅博士首先为我们介绍了常见的RNA引导的核酸内切酶系统。

王丙寅博士对CRISPR系统介导的基因编辑进行了讲解，当CRISPR的关键组分进入细胞核后，会在目标点位产生双链DNA断裂，在这之后会根据细胞核内是否同时存在有修复模板DNA而出现两种不同的结果。不存在修复模板DNA时，会形成序列不定的INDEL（基因敲除）；存在修复模板DNA时，则能够引入特定的突变或插入序列（基因敲入）。

随后，王丙寅博士分享了如何利用IDT所提供的具有创新性的产品取得高效率的基因敲除或插入。

通过化学修饰优得到更高效的引导RNA来进行基因编辑，从而使得引导RNA进入细胞核之后更稳定和有效，同时降低免疫原性和毒性。王丙寅博士为我们介绍了如何根据不同的需求选择合适的引导RNA。

引导RNA包含了一个靶向crRNA和通用tracrRNA，一般来说crRNA和tracrRNA是分开的，也更接近天然形态，但在实验室中，我们也可以将两者进行结合，成为单一的一条sgRNA。

不同形式的引导RNA各有优缺点，也是根据应用的场景不同而进行改变和选择。王丙寅博士为我们具体分析了不同形式的CAS9引导RNA在不同应用场景下的表现。

随后，王丙寅博士分享了CRISPR蛋白酶的工程学开发，通过开发具有独特特性的CRISPR蛋白酶赋予CAS9和CAS12a全新的功能，并举例了两个实例进行分析。

王丙寅博士对CAS9的递送形式作出了分析和见解，对比了质粒表达和核糖核蛋白复合体（RNP），显示RNP递送的脱靶率更低，实现更精确的基因编辑。对于基因编辑实验来讲，无论是基因敲除，还是外源模板的导入，高效的细胞核内递送对于实验的成功都是必不可少的。除了递送形式，还可以提高CAS9本身，IDT开发了ALT-R HIFI CAS9能够提高编辑特异性同时维持在目标靶点的切割活性。

最后王丙寅博士与大家共同讨论了如何使用基因编辑进行更高效率的同源重组（HDR）。更多详情，扫描下方二维码，进入课程回放。

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核转染

马顺是Lonza应用科学家，在本期直播课堂上，马顺为我们介绍了Lonza的Nucleofector™技术和Nucleofector™技与CRISPR结合进行高效精确的编辑，以及根据目前日益增长的市场需求，分享了大体积全封闭的转染方式。

Lonza成立于1897年，是一家具有百年历史的公司，目前Lonza在全球30多个国家都设有办事处，在全球有超过70个主要工厂。在生物制药领域，Lonza的产品涵盖了从药物研发到商业化的各个阶段，可以满足客户不同的需求。

马顺在讲座中对比了常规CRISPR递送方式的优劣势，包括脂质体转染、病毒转导、传统电转、以及核转染Nucleofector。相较于传统电转，核转染Nucleofector主要转染到细胞核内。核转染Nucleofector是一种高效的非病毒介导的电转方式，目前已经被国内外多家基因编辑和CRISPR实验室所使用。同时也有非常多的研究文献使用了核转染Nucleofector系统。

核转染Nucleofector系统具有多个方面的优势：（1）使用简单方便具有传统电转的优点；（2）不对底物具有依赖性；（3）工艺放大简易；（4）能够提供GMP试剂，满足GMP条件的生产。

马顺分享了核转染Nucleofector系统的的原理和一些具体实验数据，证明了核转染能够让外源基因直接进入细胞核内。核转染适用于各种原代细胞，包括CD34造血干细胞、CAR-NK、DC细胞等。

在包括ZFN、TALEN和CRISPR的基因组编辑技术中，均需要共转染。Lonza的核转染Nucleofector系统包含了硬件、特异性试剂和详细的实验方案这样一个整体的解决方案，为大家带来了高效的转导方式。

马顺为我们分享了如何开始一个高效的实验。首先访问Lonza的开放数据库，里面拥有超过600中已经优化好的试验方案，根据不同的需求找到相关的信息，参考优化好的实验方案，然后进入下一步试验，简单5步完成实验。

马顺在讲座中分享到，影响基因编辑效率的因素之一是Cas9的量和RNP的比例，并推荐了几个方案。更多详情，扫描下方二维码，进入课程回放。

马顺还为我们分享了4D-Nucleofector系统，4D-Nucleofector可以做到大体积封闭转染，同时可以从前期的小体系线性放大到10⁷-10⁹的大体系，可以实现从研发到临床的转化。并提供了具体的实验数据，表明了无论是大体积还是小体积，效率和活性都是一致的。

在细胞与基因治疗领域，法规更多要求是使用半封闭或全封闭的体系，而Lonza的全自动封闭培养系统和转染系统可以进行联合使用，实现细胞治疗的封闭培养，这也是未来细胞与基因治疗的发展趋势。

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问答环节

1

电转过程中整合效率非常低，是什么原因呢？

马顺：进行一个编辑或者转染的时候，我们首先需要看细胞的状态、电转的条件是否合适、底物是否合适、底物的一些点位、序列的设计，这些都是需要关注的问题。当然后续的实验操作也会影响，整合效率低的原因有很多。
王丙寅博士：整合插入是一个非常复杂的过程，其实当中能够对最终结果产生影响的变量也非常多，为了取得更好的实验结果。建议是选择一个比较高效的引导RNA，在这个基础上，我们还可以对修复模板的序列设计和稳定性进行优化，保证其能够有效进入细胞核中发挥作用。此外，实验中的变量是很多的，如果我们能够在每一步都做一点优化的话，实际上能够产生一个非常好的效果。
孙瑞林博士：要先确认切割和整合两件事情，确认是哪一步出了问题。如果是切割出了问题，可能需要考虑转染的效率，是否Cas9或引导RNA的形式需要调整；如果切割的效率很高，一般来说转染就不会有太大的问题，剩下的就是重组的问题了。

2

面对不同的应用场景，未来的转染主流大方向是什么呢？

马顺：在不同的应用场景中，不同的转染方式各有优点。要根据实验目的以及底物来进行考量，例如需要转染的片段较大，病毒可能就不是很合适；对于CAR-T来说，已经上市的几款产品都是病毒转染，但是对于CAR-NK来说病毒不那么合适。

3

对纯合子进行敲除，可以实现吗？

王丙寅博士：对纯合子进行基因编辑，需要在两条染色体上相同点位同时发生编辑。事实上，敲除相对来说是比较简单，但是如果我们需要在同一个细胞上发生两次相同的基因敲除，这是一个不容易的事情，同样要求也非常高。也是需要更好的实验优化，如果做出足够的努力，我觉得无论是纯合子的敲除或敲入，都是可以实现的。

4

Cas9和引导RNA之间的最佳比例是多少？

5

转染后的细胞传代后，荧光丢失了，这是什么原因？

6

sgRNA和crRNA/tracrRNA的组合相比，哪种效率高？

精彩答疑，回看课程

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