本文摘录自Robert E. MacLaren在Gene therapy 2021年的一篇综述-A 2020 vision of ocular gene therapy，作者回顾了多篇眼科领域基因治疗的文章，并从一名深耕眼科领域多年的专业医生的角度出发，归纳了他认为眼科基因治疗的几个可以关注方向。

眼睛之所以是基因治疗的理想靶器官，首先是因为眼睛相对其他器官来说体积较小，因此只需要低剂量的药物就可以达到治疗效果；其次，眼睛具有明显层层分隔的器官结构，因此可以解析明确的病理生理机制；最后，多重的血-眼屏障使得眼睛与免疫系统相对独立，因此就大大降低了诱发免疫应答或全身性不良事件的可能性。在严重的眼科疾病中，单基因疾病（多会呈现为遗传性的视网膜变性）是使年轻人视力丧失的最常见的原因。同样地，多基因疾病，例如年龄相关性黄斑变性 (AMD) 则会涉及许多补体替代途径（小编注：替代途径或称旁路途径，与经典途径的不同之处主要是越过C1、C4和C2，直接激活补体C3，然后完成C5～C9的激活过程）的相关基因，同样会导致无法治愈的失明。而目前眼科疾病的研究已经鉴定出了许多疾病相关的遗传因素，这就为基因治疗提供了一系列潜在的目标靶点。这篇文章重点为大家介绍近年来眼科基因治疗领域的几项重要研究成果。

降低眼压

为了提高腺相关病毒 (AAV) 载体介导的眼科疾病基因治疗的功效，很多科研人员已经进行了深入的研究。例如Rodriguez-Estevez 等人，就评估了不同血清型的AAV靶向眼球前房小梁网的能力（Trabecular meshwork），这是控制眼压的关键目标，并可能最终由此而治愈青光眼。研究发现， AAV2靶向小梁网的能力最强。另外，在小梁网中表达外源基因时，使用自我互补 (sc) 的双链AAV结构也至关重要，但是这一结构也将AAV的装载能力缩减成了野生型的一半。Borras等人用scAAV2载体成功地靶向小梁网并表达了基质金属蛋白酶 1（matrix metalloproteinase 1），该蛋白可以降低液体流出眼睛时的阻力。在类固醇诱导的青光眼的绵羊模型中，这一方法明显地降低了受试动物的眼压，如果将其应用于人类疾病的治疗，将具有重要的临床意义。（小编注：糖皮质激素是一类类固醇激素，是有效的免疫抑制剂，是许多炎症性疾病（包括眼部炎症）的首选治疗药物。然而，糖皮质激素会对眼睛产生显著的继发性影响，包括白内障的加重和眼内压升高，这些副作用是糖皮质激素在眼病临床应用中的主要障碍。由于严重的眼部疾病必须使用类固醇，因此寻找控制类固醇引起的眼内高压的方法对眼病治疗来说非常重要。MMP1 是间质胶原酶和小梁网支架的组成部分。在小梁网中，MMP1的表达会被类固醇药物地塞米松下调，并可以被青光眼药物拉坦前列素上调。如果MMP1表达被抑制，会导致房水流出通路的阻塞和眼压升高；而MMP1被过表达，则会有助于降低眼压。在之前的研究中，作者曾发现虽然ssAAV能够进入小梁网细胞，但却无法完成转导，这可能是由于小梁网细胞无法将病毒单链 DNA 转化为双链。因此在研究中，作者一律采用了scAAV的结构）与将 AAV 注射到眼球前房不同，将AAV注射到眼球结膜下（subconjunctival injection）可能是治疗青光眼的另一种途径。Song 等人发现在小鼠模型中，scAAV6 和scAAV8血清型在这种治疗方法上非常有效（小编注：作者发现AAV6和AAV8在角膜中的转基因产物产量最高，其中AAV6显示出对内皮层的高水平转导，而AAV8 显示出对基质层的高水平转导）。

靶向视网膜神经节细胞

除了控制眼压之外，青光眼的另一种基因治疗策略是靶向视网膜神经节细胞，使它们更能抵抗眼压导致的损伤（小编注：青光眼多是由视网膜神经节细胞死亡和视神经退化引起的。众所周知，眼压升高是与该疾病发展相关的主要风险因素，而眼压的升高则取决于小梁网对房水流动的阻力。当眼前节产生的升高的眼压被传输到眼睛后部，巩膜就会感受到眼压波动并对视神经施加生物力学应变，从而最终导致视网膜神经节细胞死亡）。Nascimento-Dos-Santos 等人评估了利用AAV向玻璃体内递送色素上皮衍生因子（pigment epithelium-derived factor）的治疗方法，他们发现这种方法可以提高挤压损伤后神经节细胞的存活率，尤其是当其与进行联合hMSC治疗时，效果更为明显（小编注：在作者之前的研究中，他们发现如果将大鼠骨髓来源的 MSC 注射到玻璃体中，可以增加视网膜神经节细胞 RGC 的存活率并促进轴突再生。因此在此文中，作者在挤压视神经后立即将 hMSC 通过玻璃体内注射到已经被AAV2.PEDF 或 AAV2.GFP预转导过的视网膜中。基因治疗与MSC联合治疗组与单独的基因治疗组相比，前者具有更高的神经元存活率）。另外Cao等人再次评估了不同血清型亚型的AAV2，在小鼠眼中转导神经节细胞的能力，结果发现 AAV2/2 在玻璃体内注射时的表现是最佳的（小编注：作者评估了AAV2/1、AAV2/2、AAV2/4、AAV2/5、AAV2/6、AAV2/8 和 AAV2/9在玻璃体内注射后的转导情况，与其他六种 AAV2 血清型相比，AAV2/2有更高的 RGC 转导效率。并且AAV对RGC 的转导效率非常依赖于RGC所处的位置，它们对靠近周边上层视网膜的RGC有更高的转导效率。虽然CAG 和 CMV 都是在眼科疾病基因治疗中被广泛采用的通用启动子，但是大家对它们在RGC 转导的相对性能却知之甚少。作者在向玻璃体内注射相同的病毒载量时，观察到这几个启动子拥有非常不同的转导效率。这几个启动子在启动子序列和在内含子剪接序列上的差异，可能是导致目的基因在 RGC 中具有不同表达水平的原因。另外，七种 AAV2 血清型亚型在视网膜内层和外层也显示出了不同程度的趋向性，例如AAV2/8 在玻璃体内注射后，就对光感受器photoreceptors具有趋向性。就目前来说，视网膜营养不良的治疗要依赖于AAV2 / 2的视网膜下注射。如果我们可以对AAV2 / 8载体的结构进行改造，则有可能通过玻璃体内注射这种侵入性较小的方式，来对视网膜营养不良的病症进行治疗）。然而，由于小鼠眼睛的玻璃体体积较小，并且小鼠眼睛玻璃体和内部限制膜的生化特征也与人不同，因此在小鼠眼睛模型上达成的结果很难外推到人类。并且即使在啮齿动物物种之间， AAV 的转导效率也存在着明显差异。Dias等人就发现，酪氨酸激酶抑制剂在被递送到小鼠玻璃体后可增对强视网膜的转导，但在大鼠中的它的增强作用却很小。从非人类灵长类动物中鉴定出的新型衣壳，例如 AAVrh-10，更是令人特别感兴趣，因为它们可能很好地转导到人类细胞当中。Zeng等人发现，与其他 AAV 血清型相比，向啮齿动物的玻璃体内注射 AAVrh-10会有比较高的外视网膜转导效率。不过在兔子眼中，AAVrh-10的转导效率则并没有这么高。同样地，Sullivan等人突变了 AAV 衣壳上的氨基酸残基，以期增加受体介导的细胞内吞作用。虽然这大大增强了修饰后AAV对光感受器的转导能力（视网膜下注射），但该AAV对视网膜的转导能力却仍然很差（玻璃体内注射）（小编注：① 通过玻璃体内注射后的AAV如果想在视网膜的光感受器进行有效的转导，需要穿过眼内部限制膜ILM。ILM 是一种富含细胞外蛋白聚糖的基底膜，并处于玻璃体和 RGC 层之间。目前仅有AAV3，AAV6和AAVShH10等对硫酸乙酰肝素具有亲和力的血清型，可以在玻璃体内给药后穿过眼内部限制膜，并有效地转导到视网膜的光感受器中。在这项研究中，作者通过氨基酸突变发现，AAV2 衣壳和 ILM 中的硫酸乙酰肝素之间是否能相互作用是AAV穿过ILM并在视网膜内转导的先决条件。AAV2-HBKO无法与硫酸乙酰肝素结合，从而失去了转导到视网膜的光感受器的能力。② 然而在经过视网膜下注射后，由于AAV不需要穿过ILM，AAV2-HBKO 反而比AAV2表现出更强的光感受器转导能力，这表明在不与硫酸乙酰肝素结合的情况下，AAV2-HBKO 介导的光感受器转导是通过利用替代受体或共受体发生的。其他不与硫酸乙酰肝素结合的AAV 血清型例如 AAV5、AAV7 和 AAV8，在视网膜下注射之后，也同样表现出良好的光感受器转导能力。因此如果将AAV3或AAV6的 HSPG 结合域拼接到非 HSPG 结合 AAV 如AAVrh8R的衣壳上，则可以使其具有通过玻璃体内注射而直接在视网膜内转导的能力）。

除了改进病毒载体转导和递送方法外，有几篇 AAV 介导基因治疗的论文还关注了一些特定疾病和它们的治疗方法。例如Georgiadis等人对AAV5 衣壳蛋白的密码子进行了优化，以开发更有效的AAV载体并用来治疗由于 RPE65 基因缺陷引起的遗传性视网膜变性（小编注：具体来说，作者引入的修改包括 ①启动子序列的优化：新启动子NA65p仅保留相对于转录起始位点的 -742 到 +15 的区域；②外源内含子的引入、Kozak序列的优化：在启动子和hRPE65之间引入了 SV40 内含子和优化后的 Kozak 序列；③RPE65 的密码子优化：替换了 7 个稀有密码子、一个隐蔽剪接位点、4 个隐蔽的过早polyA位点和一个 50 个碱基对的重复序列）。发病率很高的老年性黄斑病变AMD也是基因治疗的一个理想目标，但该病症所涉及的基因并不只有一个。Kampik等人在 AMD 小鼠模型中，使用慢病毒载体将转录因子 E2F2 递送至视网膜色素上皮 (RPE)，进而增加了视网膜色素上皮细胞的分裂速度。这种方法可能提供了一种再生机制，并可以在未来用于治疗早期 RPE 细胞的损失。

重建视网膜光敏性

在最近基因治疗研究中，光遗传学一直是另一个热门的话题。晚期视网膜变性的特征在于患者丧失了所有的光感受器，但患者剩余的视网膜层，特别是视网膜内的双极细胞却都还是完好无损的。因此使用 AAV 在这些残留但完好的非感光细胞中异位表达外源的光敏蛋白，可能会重新赋予失明患者视网膜光敏性。Hickey等人首先考察了不同血清型的重组 AAV 在体外转导视网膜的双极细胞的能力。De Silva等人发现，通过对AAV衣壳蛋白进行修饰，可以增强AAV对幼年 AMD小鼠模型中光感受器的靶向能力。这也可以使AAV有效地靶向人视网膜中的双极细胞。作为对双极细胞靶向衣壳优化策略的补充，Lu 等人针对双极细胞靶向的表达框进行了优化，他们发现MGluR6 启动子在啮齿动物和灵长类双极细胞中会诱导转基因的高强度表达（小编注：目前当科研人员想在双极细胞中表达外源基因时，多会将200-bp mGluR6增强子与basal SV40 启动子进行串联使用，而如果直接使用mGluR6启动子，表达强度则会较弱。在这篇文章中，作者在mGluR6基因的内含子3与内含子4中发现了新的增强子序列，并且通过序列删减，剔除了mGluR6启动子和内含子4中所包含的抑制子原件。因此通过序列微调，作者构建了由in4s-in3-200En-mGluR500P串联得到的启动子组件，与200En-SV40启动子相比，该启动子组件诱导外源基因表达的水平增长了20倍。in4s-in3-200En-mGluR500P序列的长度为2.2kb，因此使用AAV做载体的情况下，还可以容纳2kb的目的基因。如果目的基因较大，也可以将缩短版本的mGluR500P与200En串联使用，它的容量会达到3.5kb。此外，作者启动子组件的优化还减少了其对其他视网膜神经元的脱靶效应）。在将这项疗法推到临床实验室之前，也有一些研究对其安全性进行了评估，考察了其潜在的毒性反应。例如Sugano等人在视网膜营养不良大鼠模型中测试了一种新的视紫红质通道变体，该模型显示出对这种疗法具有良好的耐受性（小编注：在前期的研究中，作者设计了一种改良的channelrhodopsin-1 蛋白嵌合体，如果将该嵌合体转导到视网膜神经节细胞中表达，可以恢复遗传性失明大鼠的视觉功能。因此在这篇文章中，作者们试图调查 channelrhodopsin-1 蛋白嵌合体表达的安全性和对动物模型影响。他们将编码 channelrhodopsin-1的AAV2 通过玻璃体内注射给药于营养不良的 RCS 大鼠，然后再监测该病毒和外源基因在模型动物体内的传播情况。实验结果表明，外源基因的表达被特异性限制在眼组织内，而不是在非靶器官中。此外，对血液、血浆和血清的检查也表明不存在过度的免疫反应性。注射病毒后，靶向rAAV衣壳的血清抗体增加；然而，在观察期间没有检测到抗channelrhodopsin-1抗体增加。此外，视网膜组织学检查显示注射 rAAV 的大鼠没有炎症迹象。因此结果表明channelrhodopsin-1可以通过AAV进行外源表达而且不会产生明显有害的免疫反应）。Ameline等人也以 AAV 为载体通过玻璃体内注射在狗的内部视网膜中表达两种光敏蛋白-通道视紫红质蛋白和人黑视蛋白。在注射后的 16 个月内，视网膜厚度并没有发生显著变化。这些研究数据，都支持了光遗传学方法治疗失明这一方案具有很强的安全性（小编注：Nanoscope Therapeutics 公司是利用光遗传学基因疗法治疗RP的众多团队机构之一，公司近期宣布，其恢复视力的基因疗法MCO-010 的 2b 期临床试验已获得 FDA 的研究性新药申请批准，MCO-010 是一种环境光(Ambient light)激活的光遗传学基因疗法，用于恢复晚期色素性视网膜炎患者的视力，其 2b 期试验将于本月在美国各地开始。该基因疗法使用 AAV2 作为载体将 MCO1 基因传递到双极视网膜细胞中，在那里它们表达多色视蛋白，从而在不同颜色环境中实现视觉。该疗法可以在办公室环境中进行。此外，无论潜在的基因突变如何，该疗法都适用于 RP。这种疗法一次性注入眼内，无需任何硬件设备。MCO1对环境光敏感，因此不需要将强光照射到眼睛中。而且用MCO1进行治疗并不需要感光细胞保持存活，因此可以用来治疗更广泛的视网膜变性疾病）。不过随着新的有效基因疗法在临床应用中更加普遍，患者有希望在彻底失明之前就可以得到救治，从而减少对光遗传学治疗的需求。

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