在 AAV 介导的基因治疗中，制造出可以高效并有选择性地转导特定组织和细胞类型的 AAV 衣壳，是科研人员需要克服的一个难关。目前病毒衣壳改造最为通用的方法，是利用理性设计或者同源重组的方法，构建具有高度多样性的AAV 变体文库，接着将病毒文库注射到模型动物体内感染目的细胞，然后利用定向进化完成对病毒衣壳的筛选。对于大多数的AAV衣壳文库来说，其丰富的序列多样性让科研人员对病毒文库的生产过程格外小心谨慎。在病毒包装时，多个携带不同衣壳序列的质粒会被同时转染到一个细胞当中，这将对病毒的包装会产生怎么样的影响呢？小编带大家来一起看一看。
一． AAV的交叉包装与嵌合包装
AAV病毒衣壳由三种衣壳蛋白亚基 VP1、VP2 和 VP3 组成，它们以 1:1:10 的比例从同一个开放阅读框中产生，其中VP1的mRNA在经过了可变剪接后被翻译，VP2与VP3的翻译则是利用了读码框序列中的替代翻译起始点。野生型AAV 的基因组包含两个基因，分别可以编码四种复制蛋白和以上的三种衣壳蛋白，基因组两侧各有 145 bp 反向末端重复序列 (ITR)。在AAV病毒生产的过程中，携带复制蛋白与衣壳蛋白基因的质粒，会被转染进入宿主细胞，并进行转录翻译。三个衣壳蛋白亚基自发组装病毒颗粒，并将ITR与内侧的AAV基因组包装到病毒颗粒当中。
图一. AAV的交叉包装与嵌合包装
然而，对于为衣壳改造所构建的AAV 文库来说，这个病毒包装的过程要更复杂一些。在质粒转染过程中，单个宿主细胞会被转染进几百到上万个外源质粒。AAV衣壳文库具有高度的衣壳序列多样性，大量携带了不同衣壳序列的质粒会被同时转染到一个细胞当中，并在细胞中转录、剪接、翻译、包装。因此在包装AAV文库时，会出现交叉包装与产生嵌合包装的现象。简化一点来说，当细胞中同时含有病毒A的基因组与病毒B的基因组时，有可能病毒A的基因组被包装到了病毒B的衣壳中，或者病毒B的基因组被包装到了病毒A的衣壳中，这种现象就叫做交叉包装；同时，来自病毒A的蛋白亚基VP1-A可能与来自病毒B的蛋白亚基VP2-B 和 VP3-B组装，形成含有不同来源的病毒颗粒，这种现象则被称为嵌合包装。
如果交叉包装与嵌合包装也存在于 AAV 文库的生产中，这会给基于定向进化的病毒筛选造成很大的困扰，因为基于定向进化的病毒筛选非常依赖于备选病毒基因型-衣壳表型的相关性。如果AAV病毒文库失去了其基因型-衣壳表型的相关性，那么根据衣壳表型所筛选出的病毒颗粒内基因组上的衣壳序列，就不能真实的反应包裹其的病毒外壳，因此这个筛选结果就不可靠了。
图二. AAV8与Anc82的嵌合包装
二．AAV交叉包装与嵌合包装的概率与可能的机理
不过，还好在细胞中，AAV交叉包装与嵌合包装发生的概率是可以控制在比较低的范围的，这对做AAV定向进化筛选的科研人员来说，是个很好的消息。例如Nonnenmacher 等人在High capsid-genome correlation facilitates creation of AAV libraries for directed evolution一文中，就证明了在野生型AAV（在基因组结构上依旧是与野生型AAV相同的ITR-rep-cap-ITR） 的生产过程中，AAV交叉包装与嵌合包装发生的概率比较低，包装出的病毒颗粒具有很强的基因型-衣壳表型的相关性。作者在向每个细胞平均转染的400个质粒拷贝的条件下（每个 15 cm plate转染7 μg 携带了rep/cap 的AAV基因组质粒，~ 400-800个质粒/细胞），75-80% 的衣壳都包裹着与其相匹配的基因组，而不是产生了交叉包装。另外Schmit等人在Cross-Packaging and Capsid Mosaic Formation in Multiplexed AAV Libraries一文中，也量化了病毒生产条件是如何影响交叉包装与嵌合包装的发生概率。在这篇文章中，作者构建了一个由天然血清型AAV8与先祖病毒Anc82所组成的二元AAV文库。这个文库的包装是通过将两种病毒的基因组质粒共转染HEK293 细胞得到的。不过在这项研究中，作者在饱和转染的条件下（每个 15 cm plate转染13 μg 的AAV基因组质粒）所产出的 AAV8/Anc82 病毒文库，就出现了明显的交叉包装和嵌合包装的现象。但是如果降低转染时AAV基因组质粒的使用剂量，就可以降低交叉包装和嵌合包装的发生概率。并且，如果生产时使用的是野生型（包装使用的AAV是野生型，即ITR-rep-rap-ITR，而不是GOI的表达组件放置在ITR中并将rep/cap放置于另一个质粒上），也会降低交叉包装和嵌合包装的发生概率。在嵌合包装中，如果病毒颗粒富含某一病毒的衣壳亚基，那它所包裹的病毒基因组也会大概率是可以编码该亚基的。这种相关性也可以解释即使在饱和条件下生产出的AAV 文库，也可以用于定向进化来发现新的、具有组织特异性的 AAV 变体。因为病毒的主要的亚基可以很大程度上决定病毒衣壳的表型，而这个亚基又往往是由该病毒内的基因组编码的。
图三. AAV 载体基因组拯救、复制和包装模型
目前，科研人员对交叉包装与嵌合包装出现的低概率有两种假设：1. 从感染性克隆质粒中拯救病毒基因组是一个非常低效、限速的过程。于是第一个被拯救的病毒基因组可以在其他基因组被拯救之前呈指数级复制。在这种情况下，一个细胞会主要复制一种类型的病毒基因组，相应地，这个病毒的颗粒也在该细胞包装出的病毒总量中占绝大多数；2. 类似于原核的转录-翻译耦合状态，AAV的复制、转录、翻译和包装的过程，在时间和空间上可能也是耦合的，这将导致衣壳蛋白在病毒基因组附近的核孔外形成病毒颗粒，从而极大地促进病毒基因组被正确包装。
三．如何避免AAV的交叉包装与嵌合包装
为了避免AAV的交叉包装与嵌合包装，Nonnenmacher等人建议，按照每个 15 cm plate转染7 μg AAV基因组质粒的剂量，就可以在不影响文库多样性的情况下产出高滴度的AAV颗粒。Schmit等人则较为保守，他们建议按照每个 15 cm plate转染600 ng- 600 ng AAV基因组质粒的剂量来生产病毒。虽然在病毒包装中，有可能会掺入交叉包装与嵌合包装的病毒颗粒，但由于大家在做定向进化时会加入辅助病毒，被筛选的AAV在体内也是会进行复制的。因此在这个过程中，交叉包装与嵌合包装的异质病毒的含量会被大量稀释，从而保证了定向进化的筛选结果。
参考文献：
Nonnenmacher M, Van Bakel H, Hajjar R J, et al. High capsid–genome correlation facilitates creation of AAV libraries for directed evolution[J]. Molecular Therapy, 2015, 23(4): 675-682.
Schmit P F, Pacouret S, Zinn E, et al. Cross-Packaging and Capsid Mosaic Formation in Multiplexed AAV Libraries[J]. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development, 2020, 17: 107-121.
Nonnenmacher M, Wang W, Child M A, et al. Rapid evolution of blood-brain-barrier-penetrating AAV capsids by RNA-driven biopanning[J]. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development, 2021, 20: 366-378.
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