提高表达滴度：新技术可帮助其它细胞系赶上CHO
本文节选自对ATCC首席科学家Fang Tian的专访《Increasing Expression Titers: New Technologies Could Help Other Cell Lines Catch Up to CHO》。由于水平有限，详细内容，请参考原文。
Fang Tian是美国典型菌种保藏中心(ATCC)的首席科学家和细胞生物学研究及发展负责人，她也是国际细胞系认证委员会(ICLAC)和ISO/TC276技术委员会的美国技术咨询小组成员。在ATCC，她负责细胞生物学总体保藏中心内3400多种入藏动物细胞系和杂交瘤的制备、鉴定、表征、质量控制和低温保存。她拥有中国科学院药理学博士学位，曾在美国匹兹堡大学从事博士后研究。在那里，她研究了一种抗癌细胞因子，并建立了一种小鼠骨髓来源造血干细胞分化内皮祖细胞的培养方法。之后，她在哈佛医学院马萨诸塞州总医院进行了为期两年的研究项目，期间，她研究了应激介导的肿瘤细胞死亡。
今年春天，我们在线讨论了行业为提高细胞表达系统的生产水平所做的努力。
我们的对话
在过去的20年里，生物制药行业在稳定转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系的抗体表达滴度方面取得了巨大的进展。但是其它蛋白质和宿主细胞情况如何呢? 它们是否能够达到相当的水平?
抗体，尤其是单克隆抗体(MAb)，占据了生物制药市场上最大的治疗性蛋白份额。其它生物治疗产品包括肽和重组蛋白，如激素、生长因子、酶、凝血因子等。这些蛋白质可以由非哺乳动物表达系统(如细菌、酵母、植物和昆虫细胞)和哺乳动物细胞生产。
在生物制造中使用哺乳动物表达系统的最大优势是它们能够产生类似于人类细胞生产的、具有翻译后修饰(PTM)的大型、复杂蛋白质。尽管CHO细胞及其衍生系统最常用于治疗性蛋白的表达，其它多种哺乳动物细胞系也已被批准用于复杂蛋白质的生产：例如幼仓鼠肾(BHK21)细胞、小鼠骨髓瘤细胞系(NS0和Sp2/0)、人胚胎肾细胞(HEK293)以及其它人源细胞系 (HT-1080、PER.C6、CAP和HuH-7)。最近，行业对后几种细胞系的兴趣越来越大，因为尽管CHO和其它非人源哺乳动物细胞系可以产生与人内源性蛋白一致的PTM，但它们也可以产生具有免疫原性的非人源PTM。而人类细胞系则没有这个问题。人源细胞系对于治疗性蛋白质的生产来说是相对比较新的表达系统，因此它们仍然可以被改进/优化，以用于更广泛的生物治疗蛋白的常规生物生产。
新的基因工程技术 - 例如短回文重复序列（CRISPR）以及CRISPR相关蛋白Cas9 – 是如何改变我们提高宿主细胞株表达滴度和其它特性的能力的? 这与我们使用转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)和之前的其它方法相比，效果如何?
CRISPR-Cas9基因编辑技术显著提高了我们改善宿主细胞株表达滴度和其它特性的能力。基因编辑技术的进步使得通过对宿主基因组的精确修改而创造稳定、高性能、工程宿主细胞衍生物成为可能。CRISPR-Cas9技术比TALEN和ZFN技术更简单、更快、更便宜。它使用一个带有与目标DNA互补区域的引导RNA来特异性识别结合位点，并对DNA产生双链断裂。CRISPR/Cas9能够灵活设计，以靶向给定的基因组区域，且有可能实现“多路复用”，以同时修饰多个基因。
一旦宿主DNA出现双链断裂，科学家就可以通过非同源端连接或同源定向细胞修复机制，引入所需的基因修饰。通过敲入、敲除或突变调控细胞生长、细胞死亡、新陈代谢、蛋白质合成和折叠的关键基因，可以产生所需的宿主细胞表型。这种基因修饰可以在不引入外源序列的情况下对宿主细胞基因组进行永久的修饰。这是一种提高细胞健康性并有效控制细胞伴侣和核酶的理想方法，以实现适当的抗体和其它糖蛋白的PTM。这些好处也适用于病毒生产。
许多疫苗(特别是流感疫苗)是使用基于鸡胚的生产系统生产的。然而，CRISPR/Cas9基因编辑技术的应用可以彻底改变疫苗生产的宿主细胞系。最近，ATCC利用CRISPR/Cas9技术，通过修饰Madin-Darby犬肾 (MDCK)和猴肾源Vero细胞系的细胞信号通路，提高了病毒生产能力，这是两种用于疫苗生产的常见宿主细胞。通过敲除抗病毒防御基因(针对STAT1蛋白)，我们获得了修饰的细胞，其病毒表达滴度增加了10倍以上。新开发的细胞系有助于提高病毒产量，并显著降低疫苗成本。
在优化细胞系表达滴度时，是否很难保持产物质量?会出现什么样的问题，你们是如何解决这些问题的?
这是一个非常有挑战性的过程。许多细胞培养参数可以显著影响产物质量和效力：例如，温度、pH、渗透压、气体流速和平均值、搅拌罐内的搅拌速度和代谢物水平。此外，在生物工艺过程中，生物因素也会造成很大的可变性：如细胞密度和活性、线粒体活性、LDH和NADH的水平。所有这些都可能影响蛋白质糖基化、PTM和杂质特性。
除了对宿主细胞系进行工程设计、以获得所需特性外，培养参数的优化对于获得高表达滴度、同时满足质量要求也至关重要。此外，工艺放大是获得大量产品的必要条件，而放大过程受细胞培养参数和生物因素的影响很大。我们在严格控制整个上游培养工艺方面做了很多工作- 从生产克隆的冻存小瓶开始到培养液收获结束。然而，我们需要更好地理解细胞培养中变异性的来源，并掌握关于影响细胞生长和生产力的因素的多样性的更多知识。
瞬时转染可在实验室规模下生产少量用于测试的物质，但不用于临床或商业化生产。这与表达滴度有关吗?是否有工作致力于提高瞬时转染HEK293甚至CHO细胞的滴度?
稳定生产细胞系比瞬时转染细胞更适合大规模生产。这与表达滴度无关。稳定生产细胞系在可重复性和可放大性方面具有许多优势。然而，行业也需要瞬时转染。它允许快速和并行生产，而不需要构建专用的生产细胞系，后者通常是一个昂贵且耗时的过程。
瞬时转染适用于旨在筛选的小规模(例如，基于摇瓶) 抗体生产，但它也可以放大到批次或补料分批生物反应器工艺。一些研究人员正在尝试提高瞬时转染HEK293细胞的滴度。有报道称，对用于蛋白质生产的转染工艺和哺乳动物表达载体进行优化，可使重组抗体的单位体积产量达到>0.5g/L。
提高瞬时转染HEK293细胞的滴度在基因治疗领域也很有意义。病毒载体已成为一种灵活且高效的基因治疗载体。但由于临床试验需要大量的病毒载体，行业迫切需要提高瞬时转染宿主细胞生产的滴度。瞬时转染是产生高质量载体的常用方法。然而，规模放大是一个重大挑战。尽管在提高滴度和放大病毒载体生产工艺方面已经取得了巨大的进展，但要取得重大突破还需要更多的努力。
许多病毒生产商使用昆虫细胞和杆状病毒表达载体系统(BEVS)。使用这种方法，你现在看到能获得什么样的滴度，有什么样的工作正在提高它们?
腺相关病毒(AAV)载体的大规模生产主要有两种系统：HEK293人类细胞系和BEVS的Spodoptera frugiperda (草地贪夜蛾，Sf9) 昆虫细胞。这两个系统都成功地证明了它们在生产商业化治疗性产品方面的可放大性和能力。Sf9- 杆状病毒平台的产量是瞬时转染HEK293细胞的数倍。然而，对于昆虫细胞系统，需要大量的前期投资，以克隆和建库两种重组杆状病毒。Sf9- 杆状病毒平台更难实现感染的一致性和质量控制。改进该系统的另一个重点领域将是减少不包含目的基因的空衣壳的产生。
感染杆状病毒载体的昆虫细胞也能高效表达重组蛋白。一个常见的问题是，昆虫细胞产生的N-聚糖前体会被修剪，因此它们不会发育成末端半乳糖和/或唾液酸残基。此外，潜在的副作用可能来自杆状病毒诱导的哺乳动物细胞先天免疫反应。昆虫细胞工程可能是解决这些问题的有效途径。在开发具有人源化蛋白糖基化机制的转基因昆虫细胞方面已经取得了一些进展。而在改变细胞基因表达和/或细胞信号通路方面还需要进一步的工作。
在最近的一次谈话中，有专家提醒我不要过于关注滴度，他认为更应该关注单位体积产率，例如，在比较微生物和哺乳动物细胞培养的产量时。您如何看待滴度和单位体积产率之间的关系? 优化一个参数就一定会优化另一个参数吗?
随着对大量治疗性抗体的巨大需求，高表达滴度不是唯一的追求。对于大规模生物药生产，滴度和单位体积产率都非常重要。尽管它们通常是相互关联的，但优化其中一个并不一定会导致另一个的优化。
例如，针对高水平表达治疗性蛋白质而优化的细胞培养基和参数可能不是优化生产规模放大的相同参数。为了在一个规模放大的工艺中为细胞提供适当的生理环境，生物反应器的配置和这些细胞的化学要求都必须得到满足。许多不同的培养参数和生物因素相互联系，有时甚至相互竞争。此外，表达蛋白的质量与高滴度并不直接相关。
除了关注提高蛋白质治疗产品的生产，开发商还应强调提高重组蛋白产品的质量(如稳定性和准确的糖基化)。在病毒生产中，终产品的感染能力与滴度同样重要 - 如果不是更重要的话。
对于表达滴度，硬件设备会产生什么样的不同作用?
生物药的最终生产力和大规模生产受到诸如生物反应器、灌流技术和控制系统等硬件的极大影响。行业会采用批次、补料分批和连续/灌流培养模式生产重组蛋白生物药。其中最容易操作的可能是批次模式，所有必需的营养物质都在初始培养基中提供。补料分批的使用更普遍，因为相比批次模式，它允许进行更长的培养时间，从而提高最终的产量。灌流可以同时去除废物并提供营养物质。
灌流正成为利用哺乳动物细胞生产治疗性抗体的首选方法。这种系统可降低抗体在生物反应器中的滞留时间。
在连续、端到端整合式生产单元中，灌流模式更有可能发挥其全部潜力。优化的连续培养和捕获工艺已被证实可显著提高单位体积产量。
生物反应器类型和工艺控制也是构建和优化用于治疗药物生产的生物工艺中需要考虑的重要因素。最近在高通量设备和一次性使用培养系统方面取得了很大的进展。所有这些生物制造中新硬件的发展最终将降低生产成本，提高灵活性，并提高作为终产品的生物药的数量和质量。
原文：C.Scott, F.Tian, Increasing Expression Titers: New Technologies Could Help Other Cell Lines Catch Up to CHO. BioProcess International, 2021.
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