一次性使用技术之于病毒载体工艺开发
本文节选自《Single-Use Technologies Prove Effective for Viral Vector Process Development》，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
上游病毒载体工艺可能对下游的纯化要求有重大的影响。血清、培养收获活性、浊度、细胞裂解试剂、污染性DNA水平和残留转染试剂的存在都是上游影响因素。Pall Biotech高级研发经理Todd Sanderson表示，无论是贴壁形式还是悬浮形式，整个工艺的可放大性和稳健性都取决于生物反应器的性能。他说:“提供可再现和均一的理想微环境的能力是生物反应器中获得可再现和均一载体生产的先决条件。”
一次性使用技术 - 如摇瓶、摇摆式生物反应器袋以及更大的生物反应器袋 - 被越来越多地用于从实验室到商业化规模的病毒载体生产，包括上游接种液的扩增和生产步骤。与不锈钢系统相比，这些技术具有多方面的优势，包括减少投资、消除CIP和清洗验证。龙沙（Lonza）研发高级总监Atul Mohidra表示，这些优势降低了总体污染几率，提高了生产设施的效率，同时降低了生产成本 (运营和维护)。
虽然一次性使用系统可能也有一些缺点，但Charles Rivers子公司Cobra Biologics的技术总监Tony Hitchcock认为，好处远远大于问题。他断言:“最简单的现实是，COVID-19大流行显示了一次性使用系统的好处，因为不可能在现有的时间和规模内部署病毒疫苗。”
特别是基于腺相关病毒(AAV)的载体的生产，这是用于基因治疗递送和病毒载体疫苗的最常见的一种载体类型，最近的数据表明，不锈钢会对AAV的感染性产生负面影响，这更强化了使用一次性使用技术的策略，Pall Biotech病毒载体和基因治疗技术经理Emmanuelle Cameau说。
从实验室到商业化规模的一次性使用选择
根据开发阶段、所需的生产规模、正在生产的特定载体、使用的细胞类型以及病毒是从培养基、细胞还是两者中收获的方式，可以使用多种不同的一次性使用系统来生产病毒载体。Cytiva战略经理Chor Sing Tan说，最常用的一次性使用系统包括T型烧瓶、滚瓶、细胞工厂或细胞堆栈、摇摆式生物反应器、固定床培养系统以及搅拌罐生物反应器。
“传统的实验室规模系统，如滚瓶或设计用于贴壁细胞的细胞工厂，通常用于病毒载体的小规模生产，而固定床培养系统和搅拌罐生物反应器分别是用于贴壁和悬浮工艺的主要方式，”Tan说。此外，也有研究使用支持贴壁细胞系的微载体，以在搅拌罐生物反应器中以悬浮方式进行贴壁细胞培养的规模放大。
Tan表示，在大规模工艺和小规模生产中，培养瓶通常被用于种子扩增。例如，T型瓶通常用于传代培养，而细胞工厂主要用于培养贴壁生长的细胞。滚瓶比T型瓶简单，但需要机械装置来旋转。细胞工厂有其自身的局限性，如可变体积以及缺乏足够的气体交换来实现最佳的细胞生长。对于所有这些系统，大量的手工操作和开放式操作排除了它们在商业化规模上的实际应用。
摇摆式生物反应器、固定床生物反应器和搅拌式生物反应器确实能够实现无菌、封闭操作并易于自动化。Tan表示，它们还可以增加细胞培养密度，同时保持足够的气体交换和营养供应，防止细胞培养副产品的积累。
Sanderson补充说，特别是对于一次性使用系统，细胞培养的兼容性至关重要，因为许多用于生物药生产的塑料和聚合物在生物工艺过程中并不是“惰性”的。“除了溶出/析出外，塑料表面吸附也有造成营养损失的风险。这些问题可以通过筛选这些材料在每个工艺中的相容性来解决，”他评论说。
需要更高的商业化产能
许多用于基因治疗的病毒载体生产工艺最初是在学术实验室使用传统的塑料制品系统 (如多层培养瓶) 开发的。当这些候选产品进入临床时，这些工艺通常被保留下来。Univercells Technologies市场和产品管理副总裁Marie Jourdan表示，对于一些载体需求量较低的基因治疗适应症，这些一次性使用系统仍然是首选技术，其可提供足够的产量，并消除了对工艺更改的需要。
然而，培养瓶在可放大性、可靠性和工艺优化方面众所周知的局限性已经引起了最终用户的注意。“规模扩展以获得大量病毒载体的方式存在一些缺点，会导致占地、资金、运营费用和可再现性问题。因此，与2D技术相比，开发商正在转向具有更高产量和规模经济的可放大技术，同时减少占地面积、手动操作和商品成本，”Jourdan说道。
Cameau说，与扁平培养系统相比，大规模一次性使用生物反应器生产同样数量的病毒载体产品所需塑料更少。这意味着之后必须处理的塑料数量也会减少。
搅拌罐生物反应器悬浮培养和固定床生物反应器贴壁培养已成为主要选择。Cameau表示，这两种反应器都比扁平培养系统提供了更多的过程控制，因为生物反应器包括用于监测pH、溶氧(DO)、二氧化碳百分比和其它参数的传感器。
自动化生物反应器，Cameau补充说，在贴壁工艺中提供了优化细胞培养基/表面积比率的机会。她解释说:“与扁平培养器皿相比，固定床生物反应器的比例通常要低得多，因此需处理的上游总体积更小，下游需处理的体积也相应地更小。”Sanderson说，细胞培养基的利用也趋向于更有效，从培养基利用研究中获得的信息可以用于在所有规模和形式中平衡成本和性能。
贴壁 vs. 悬浮细胞培养
如前所述，病毒载体生产商可以在悬浮和贴壁生产平台之间进行初步选择。贴壁和悬浮生物反应器的关键区别在于是否有支持细胞生长的物理表面。Sanderson说，这种物理表面使工程设计更为复杂，需要在整个生物反应器中提供均一的受控环境。
他还指出，贴壁表达系统通常依赖于含血清的培养基配方，而动物源性成分会导致引入外源性物质以及保持生物原材料一致性的额外风险，这可能导致相比化学限定培养基系统更多的生物差异性。
贴壁培养需要使用胰蛋白酶来分离细胞。活性胰蛋白酶的存在改变了细胞代谢和细胞内形态。血清用于灭活胰蛋白酶，但是血清的批次间差异和不稳定性可能会导致胰蛋白酶灭活程度的波动，从而导致对宿主细胞状态的控制降低。残留的激活胰蛋白酶也可以使许多病毒载体失活，”赛默飞世尔生物生产业务创新副总裁Natraj Ram说。
Sanderson继续说，贴壁工艺还涉及到更复杂的种子扩增链，需要使用更多的培养器皿或另一个贴壁生物反应器系统，因为接种贴壁生物反应器需要大量的细胞。
Hitchcock说，由于这些原因，也由于用于大规模生产的贴壁系统选择有限，许多病毒载体和基因治疗开发商现在把重点放在悬浮平台上。
Hitchcock表示，悬浮工艺广泛可用的规模缩小模型，如Sartorius的ambr平台，允许探索工艺强化，将载体生产率提高到与贴壁平台相当的水平。他说:“这些系统还提供了规模化商业生产的途径，对于以腺相关病毒(AAV)为基础的疗法尤其是这样，所以，越来越多的生产商正在寻求规模高达2000 L的生产。”
Cobra Biologics也看到越来越多的公司正在开发稳定生产细胞系，特别是用于慢病毒(LV)载体的生产，这种载体更容易转移到悬浮平台，并有可能在2000L以上的规模中运行。
即便如此，Sanderson观察到贴壁生物反应器在处理细胞内产物(如基于AAV2血清型的产物)方面比悬浮生物反应器更具工艺优势，在这种反应器中，细胞的附着允许细胞以相对较低的体积裂解，从而减少了所需的下游纯化步骤。
此外，根据Ram的说法，贴壁和悬浮一次性使用生物反应器都能与其它一次性使用技术很好地整合。此外，虽然有必要确保细胞在整个反应器基质中的均匀分布以及固定床生物反应器中反应的转染复合物的均匀分布，他指出，与传统搅拌罐中的悬浮工艺相比，在接种和转染过程中转移的体积可以减少。
Jourdan指出，实际上，搅拌罐反应器已经被证明为生物药生产提供了一种可放大的解决方案。然而，她表示，使用该系统，产能随操作体积线性增加，对于需求量非常高、而生产率非常低的应用，可能需要多个单元并行运行，这将显著影响占地和资本支出。
Ram补充说，如果使用固定床生物反应器系统，且载体存在于细胞中，那么在收获步骤中也有可能进一步降低体积。使用这种方法，所有的反应器培养基都可以在收获之前处理掉，并且可以完成小体积收获步骤。“对于悬浮工艺，必须开发一个单独的收获步骤，这增加了一些复杂性，但倒也不是一个关键，”他评论说。
最后，Ram指出，在固定床生物反应器中使用灌流比在传统的搅拌罐中更简单，因为细胞附着基质本身就充当了细胞截留装置，而在悬浮培养中，则需要一个外部细胞截留装置。“即使在AAV血清型主要存在于细胞内的情况下，通常仍有20-30%存在于耗竭的培养基中，大多数药物生产商会选择保留。”
尽管Ram指出了贴壁细胞培养的优势，但他认为，在悬浮与贴壁模式之间进行选择时，应该考虑传统搅拌罐领域中一次性使用技术的成熟性，以及进一步放大工艺的能力。他断言：“应该强调基于悬浮的病毒载体生产的进步，应该开发新的技术，将基于悬浮的培养与可提供与贴壁模式相同优势的能力结合起来。与许多新技术一样，”Ram继续说道，“行业采用仍然是一个挑战，需要通过整个行业的合作来解决。”
原文：C. Challener,“Single-Use Technologies Prove Effective for Viral Vector Process Development,”BioPharm International, 34(8) 2021.
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