如何制备2亿剂mRNA疫苗：mRNA的合成和纯化
本文节选自来自美国宾州大学的研究人员发表的文章“Manufacturing Strategy for the Production of 200 Million Sterile Doses of an mRNA Vaccine forCOVID-19”，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
mRNA的合成和纯化
mRNA的合成：体外转录
mRNA的合成将通过称为体外转录（IVT）的过程、以无细胞的方式完成。在IVT过程中，一种叫做T7 RNA聚合酶的酶基于互补DNA模板、使用游离的核苷酸碱基合成一条mRNA链。这一过程可在WAVE生物反应器200系统中进行，该系统组成包括一个摇摆器，其上放置一个一次性使用塑料生物反应器袋。每个IVT反应使用一个200 L的袋子，其中110L为反应体积，即占用袋子110 L的工作体积。装袋前，将袋加热至反应温度37℃。接下来，将99 L的反应成分泵入袋中；这99L体积由反应缓冲液 (Tris-HCl、MgCl2、二硫苏糖醇(DTT)、亚精胺和Triton X-100)、DNA模板、核苷酸碱基、用于共转录加帽的帽类似物以及注射用水 (WFI) 组成。最后泵入11 L的T7 RNA聚合酶，这样，直到所有反应成分都被泵入袋内，反应才会开始。使用pH监测器确保pH为8.1。当所有成分装入袋内后，将摇摆速度设置为每分钟4摇，并将摇摆角度设置为2°，以避免反应内容物过度摇晃。IVT反应将持续5小时。
IVT反应之后，必须进行酶消化步骤，以帮助降解不需要的成分。IVT反应运行5小时后，加入DNase I来降解IVT反应后残留的DNA模板。5小时后再加入磷酸酶；磷酸酶将使未加帽mRNA的5 '端去磷酸化，从而使其随后被降解。加入这两种酶后，在相同的温度、pH值和摇晃条件下，在WAVE生物反应器中孵育30分钟。IVT反应和随后的酶消化完成后，将袋内的内容物泵入一个储罐。来自储罐的溶液将被泵至第一个切向流动过滤步骤。
mRNA的纯化：层析前的切向流过滤
IVT反应器产生的溶液含有许多在最终药物制剂中不需要的不良元素，包括：双链mRNA、 DNAse、磷酸酶、质粒DNA、游离NTP、Triton-X-100、T7 RNA聚合酶、帽类似物、氯化镁、Tris缓冲液、亚精胺和二硫苏糖醇。因此，需要对溶液进行过滤，以去除不需要的元素。一项公开的、专注于mRNA纯化的专利建议使用切向流过滤、层析、再使用另一步切向流过滤，以去除所有不需要的污染物，只留下纯的单链mRNA。选择这种设计的原因是，与其它过滤工艺相比，TFF不会对mRNA的稳定性产生负面影响。事实上，与IVT混合液中RNA的存储稳定性相比，在至少一个TFF步骤后，RNA可能获得更高的存储稳定性。
因此，在IVT反应器之后，产物溶液首先用切向流动过滤设备 (在我们的工艺中也称为TFF1)进行纯化。该单元操作的目的是从IVT产物溶液中除去除mRNA外的所有元素。TFF1以洗滤方式进行。为了确保mRNA被纯化，我们选择了截留分子量 (MWCO) 为100 kDa的超滤膜。这可确保mRNA由于其大小而不能通过过滤器。用于此工艺的缓冲液选择为水，因为在层析柱之前不需要进行缓冲液置换。根据专利的建议，TFF1使用10个体积的水进行洗滤（10 DV）。
由于IVT产物的体积是110 L，这意味着在这个使用10 DV的工艺中，作为缓冲液，所需的水的体积将是1100 L。TFF1的截留液包括mRNA (单链和双链) 和水。截留液体积选择为110 L，因为我们希望将IVT产物溶液的体积设置为截留液的体积 (即TFF1仅用于洗滤，不浓缩整个溶液)。这意味着TFF1的滤液体积将为990 L。TFF1的滤液中将包括：DNAse、磷酸酶、质粒DNA、游离的NTP、Triton-X-100、T7 RNA 聚合酶、帽类似物、氯化镁、Tris缓冲液、亚精胺和二硫苏糖醇。根据专利的建议，TFF1的通量被设定为70 L/h/m2。此外，工艺时间设置为2.5小时。根据明确的工艺变量，计算出膜表面积为6.29 m2，流速计算为440 L/hr。专利提到98%的mRNA将在截留液中被回收，这也是我们工艺设计的考虑因素。这意味着520 g的mRNA将被输入TFF1，其中510g在截留液中被回收。随后，在这个步骤中，mRNA从每升0.5 g浓缩到每升5 g。
mRNA的纯化：层析
TFF1的产物被注入基于纤维素的快速蛋白质液相层析 (FPLC)，其与dsRNA结合。不需要的dsRNA有一种独特的特性，可以与纤维素填料结合。该层析柱的参数根据2019年发表在《核酸分子理论》(Molecular Theory of Nucleic Acids)上的一篇文章中纤维素层析柱的规模放大计算得出。
该工艺使用层析缓冲液制备纤维素填料并稀释上样至层析柱的mRNA。缓冲液储存在层析缓冲储罐中，含有16%的乙醇(体积比)、水、NaCl、EDTA和HEPES。16%乙醇的组成至关重要，因为研究表明，更高的浓度会导致dsRNA和ssRNA结合到层析柱上。用275kg纤维素和1540 L缓冲液制备填料，形成均匀的浆料。填料加入层析柱，并在重力作用下沉降。
使用前，用1个柱体积的缓冲液漂洗FPLC层析柱。然后将来自TFF1的110 L mRNA上样至层析柱。mRNA流穿过层析柱，超过96%的dsRNA会与纤维素层析柱结合。一段时间后，用无核酸酶水清洗层析柱，为下一次运行做准备。通过与专家顾问的交谈，我们决定以相同的回收率重复使用填料。
这个过程在4℃下进行。文献表明，在更高的温度条件下，回收的ssRNA的百分比保持不变，但未结合的dsRNA的百分比会提高。考虑到这一点以及提高温度所产生的额外成本，这个过程将在室温下进行。（原文如此，不知是否理解有误。）
FPLC可有效去除大小在21~ 500 bp之间的dsRNA。该层析柱可用于去除不同大小和不同核苷组成的dsRNA。这一过程不会损害mRNA的完整性 – 这一点很重要，因为任何由纤维素引起的mRNA质量的下降都会影响到剩余的制造过程，甚至可能导致安全问题。
mRNA的纯化：层析后的切向流过滤
如上所述，在层析步骤之后，不需要的dsRNA从工艺溶液中被去除，只留下理想的产物：单链mRNA。然而，现在有必要去除由于层析步骤而在溶液中出现的不需要的污染物。从层析柱流出的溶液必须去除不需要的污染物，因为它们不应出现在最终的药物制剂中，包括：HEPES、EDTA、氯化钠和乙醇。类似于IVT反应器之后所做的，切向流动过滤步骤是必要的，以从溶液中的单链mRNA中去除这些污染物。在层析柱之后设置切向流动过滤系统的设计选择，与专利内容相符。
因此，在层析柱之后，产物溶液首先用切向流动过滤装置 (在我们的工艺中也称为TFF2)进行纯化。这个单元操作的目的是从层析产物溶液中除去除mRNA外的所有元素，并进行缓冲液置换。为了确保mRNA被纯化，我们选择了截留分子量 (MWCO) 为100 kDa的超滤膜。这可确保mRNA由于其大小而不能通过过滤器。用于这一工艺的缓冲液选用50 mM的醋酸钠，因为这将准备好RNA溶液，以进行下游的LNP制剂工艺。根据专利的建议，TFF2使用醋酸钠进行10体积的洗滤 (10 DV)。由于层析后产物的体积约为126 L，这意味着使用10DV的这个工艺所需的醋酸钠缓冲液体积为1262L。TFF2的截留液将包含单链mRNA和醋酸钠。截留液的体积选择为126L，因为我们想将层析产物溶液的体积设置为截留液的体积 (即TFF2仅用于洗滤，不浓缩整个溶液)。这也意味着TFF2的滤液体积约为1136 L。TFF2的滤液中将包括：HEPES、EDTA、氯化钠、乙醇和醋酸钠。TFF2的通量设定为82.5 L/h/m2，这是专利所建议的。此外，工艺时间设置为2.5 小时。根据确定的工艺变量，计算出膜表面积为6.12 m2，流速为505 L/hr。专利中提到98%的mRNA将在截留液中回收，这也是我们工艺设计中考虑的因素。这意味着505g mRNA进入TFF2，在截留液中回收495 g。随后，在这个步骤中，mRNA从每升0.4 g浓缩到每升4 g。
mRNA的纯化：除菌过滤
在我们的工艺中，mRNA溶液离开第二个切向流过滤步骤后，使用除菌过滤设备进行过滤。溶液的除菌过滤是进入整个工艺的第二步，即LNP制剂之前，的最后一步纯化。除菌过滤的目的是通过去除被过滤样品中的所有细菌和微生物污染物，来确保mRNA产品的无菌性。在生产过程的这一步中，mRNA产品使用0.2 µm膜直接过滤至最终的储存容器中。预期过滤器的产品回收率可达100%。
原文：I.Labarta, S.Hoffman, A.Simpkins, Manufacturing Strategy for the Production of 200 Million Sterile Doses of an mRNA Vaccine for COVID-19. 2021.
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