利用稳定生产细胞系开发商业化慢病毒载体生产工艺：上游工艺考量
本文节选自GSK细胞 & 基因治疗上游载体工艺开发团队主管Peter Archibald和下游工艺开发经理Anthony Shillings发表的文章“Enabling development of commercial-ready lentiviral vector manufacturing processes using stable producer cell lines”，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
简介
对于自体细胞和基因疗法来说，病毒载体的生产往往是供应链中最昂贵的组成部分之一，而且往往是临床开发项目的关键路径。慢病毒载体 (LVV) 通常用于这些治疗，因其能够递送序列并稳定地整合到分裂和非分裂细胞的宿主细胞基因组中，且其具有广泛的趋向性。
目前，LVV生产工艺的行业标准是将质粒DNA瞬时转染到宿主细胞系中，从而生产载体，同时，下游工艺涉及深层过滤、层析和切向流过滤步骤的使用。以贴壁细胞培养系统培养的宿主细胞系常用于LVV上游工艺，尽管对宿主细胞系进行驯化以适应悬浮培养的工作已经取得了重大进展。通过悬浮培养瞬时转染生产LVV时，通常获得的感染性滴度为>1 × 10^6 TU/mL，最近有报道显示，经过对转染条件的优化，感染性滴度可达1× 10^8 TU/mL。与贴壁系统相比，基于悬浮培养的工艺已经被证明可以将LVV生产的产品成本降低90%。然而，下游工艺步骤也被发现会对LVV批量生产的产品成本产生显著的影响，而且，由于处理体积的增加，悬浮工艺的引入对LVV下游工艺提出了新的挑战。
近年来，稳定LVV包装和生产细胞系的发展也在加快。历史上，已经证明制备稳定的慢病毒载体包装或生产细胞系是可行的；然而，收获时达到的感染性滴度通常较低 (<1 × 10^7 TU/mL)。组成型表达的载体包装或转基因序列的毒性也使得适合生产LVV的细胞系的开发具有不小的挑战性。最近，一些研究小组报道了制备的适应悬浮培养的LVV稳定生产细胞系(PCL)，在诱导条件下，能产生>1× 10^7 TU/mL的感染性滴度。例如，葛兰素史克 (GSK)已将编码LVV包装和转基因序列的细菌人工染色体(BAC)用于稳定PCL开发，该技术已获得国际专利WO2017/089307和WO2017/089308。这种BAC技术允许通过转染单个DNA结构快速生成稳定的PCL，并有可能显著减少细胞系开发工作所需的时间。将这种细胞系用于上游生产工艺有可能简化LVV生产的操作和供应链，这将在本文中进一步讨论。在上游LVV工艺中引入稳定PCL对下游工艺也有重要影响，这也将在后续章节中介绍。
LVV上游工艺的考量
利用瞬时转染生产第三代LVV的上游工艺通常需要四种质粒DNA结构，以编码包装部件、囊膜和转基因序列。这些质粒DNA结构每一批次的生产都必须达到临床或商业化供应所需的质量，可能需要制备细菌细胞库，以确保供应的连续性(图1)。这是在为宿主细胞系(通常是HEK293源性) 构建生产细胞库之外的工作，一般使用两层主细胞库(MCB)和工作细胞库(WCB)系统，并且必须适用于GMPLVV批次生产。虽然包装质粒批次和生产细胞库可以用于生产编码各种治疗性转基因的LVV，但采购这些起始物料需要大量的开支，也增加了供应链的复杂性。这些原材料的生产通常外包给合同制造商，并取决于他们的可用产能，这可能由于所需起始物料批次的数量，而导致时间的延长。这些起始物料的批次也必须很好地表征，并很好地理解其生产过程，以用于临床和商业供应，这可能会增加开发生命周期的时间和成本。这些物料的生产、质量和稳定性的可变性也有可能影响LVV批次质量和工艺稳健性。
图1. 用于基于瞬时转染 & 稳定PCL的上游LVV工艺的原材料和起始物料
对于用于生产LVV的每一个稳定PCL也应该建立两层细胞库，因为这些都是针对每一个LVV转基因的。然而，使用稳定PCL的工艺不需要外包质粒DNA批次。考虑到这些细胞系的转基因特异性，需要细胞系开发工作来产生每一个LVV稳定PCL，每一个都需要大量的时间(大约6-9个月)和资源来完成。目前，整个行业对LVV稳定PCL的细胞系开发经验有限，需要进一步了解不同的治疗性转基因如何影响LVV稳定PCL的制备，哪些稳定PCL属性影响LVV的生产。
除了起始物料的采购，上游LVV工艺还必须采购合适的原材料。基于贴壁细胞培养系统的病毒载体生产通常使用含有动物源性成分(如血清)的细胞培养基，而无动物源性成分 (ADCF)或化学限定 (CD) 培养基配方现在被用于悬浮系统中的病毒载体生产。此外，对于基于瞬时转染工艺，还需要转染试剂。多种类型的转染试剂可有效地将质粒DNA递送到宿主细胞中，例如，基于阳离子脂质或磷酸钙的转染，这些产品在大规模悬浮工艺中的适用性不同。近年来，基于聚合物的转染试剂(如聚乙烯亚胺)已被证明适用于瞬时转染和病毒载体的生产，并可在GMP生产中提供合适的质量。现在也有一些专有的转染试剂；然而，在为大规模生产进行采购时，购买这些产品可能会大大提高病毒载体批次的产品成本。此外，通常需要证明可通过下游工艺适当地清除这些原材料，而根据所选转染试剂的成分，可定量检测这些材料浓度的方法的开发可能具有一定的挑战性。
相比之下，基于稳定PCL的上游LVV工艺的原材料采购可以更加直接。四环素诱导系统(Tet-on)常用于LVV稳定PCL，其需要四环素或强力霉素的存在，以激活基因表达和病毒生产。这些试剂通常相对便宜且无专利，并可以采购到药典级产品。与转染试剂类似，还应评估下游工艺清除诱导试剂的能力。然而，使用这些试剂的风险可能相对较低，因为上游工艺仅需要较低的浓度，下游工艺可以显著地消除这些试剂，且鉴于这些试剂在药品中被用作抗生素，所以可以采购到所需的级别。考虑到这一点，在下游工艺结束时，这些试剂的浓度可能会显著低于人体每日允许暴露(PDE)。对于离体细胞和基因治疗，这些试剂的额外清除也可能发生在患者细胞的处理过程中，在这一过程中，经常需进行LVV转导和多个培养基置换步骤，因此患者的风险可能会进一步降低。在工艺开发过程中应评估稳定PCL的遗传稳定性，以确定是否需要维持培养中的抗生素选择。在LVV生产过程中使用抗生素会对材料采购、工厂控制和废物处理带来重大挑战。因此，在不进行抗生素选择的情况下，建立稳定PCL的遗传稳定性是有利的。
LVV生产工艺通常从低温贮藏WCB瓶的解冻开始，细胞以贴壁或悬浮形式进行接种，并通过多次传代以进行细胞扩增，从而获得足够的细胞量，按所需的规模和细胞密度接种生产罐(图2)。这些步骤适用于瞬时转染或基于稳定PCL的工艺。典型的悬浮工艺种子种子扩增单元操作可以应用于稳定PCL，包括细胞库解冻和细胞培养，如摇瓶、摇摆式生物反应器和搅拌罐生物反应器。此外，生物药生产工艺中上游单元操作的一次性技术的使用可简化操作并降低生产过程中的微生物污染风险，这些技术现在也正被应用于病毒载体的生产。
图2. 使用悬浮细胞培养系统的LVV上游工艺的典型单元操作
为了达到生产罐接种所需的细胞活性和活细胞数量，并降低种子扩增的持续时间，需要优化宿主细胞系和稳定PCL的种子扩增参数。对于稳定PCL，应该考虑克隆的生长和代谢情况。如果所选的稳定PCL表现出细胞倍增时间延长、解冻后细胞恢复差或细胞扩增期间细胞活性低，这种优化将变得至关重要。这些特征可能与细胞系开发过程中的克隆选择过程或载体包装序列或转基因序列的组成性表达有关。如前所述，还必须证明每个稳定PCL培养的遗传稳定性，以建立体外细胞老化 (LIVCA) 限制，以满足规模化LVV批次生产所需的细胞倍增次数。Chen等人已经证明，这对LVV稳定PCL是可行的，并且已经制备了优化的细胞系，其在抗生素选择存在的情况下，进行20次以上倍增仍可保持功能和遗传稳定性。这将足以从单个冻存管经过多次传代培养1 × 10^7活细胞，并以活细胞密度2 × 10^6 cells/mL接种一个5,000L生物反应器。
对于LVV的大规模生产，使用稳定PCL比瞬时转染具有显著的优势。基于瞬时转染的工艺通常需要使所选的转染试剂与质粒DNA形成复合物。除了该过程和这些成分的使用所带来的潜在可变性之外，该步骤还会在工艺规模放大期间带来挑战。在大规模条件下，开发有效的复合物形成步骤，需要优化与混合动力学(如混合/添加方法、时间、温度等)和复合物成分(如质粒DNA- 转染试剂比例、复合物形成介质、复合物体积等)有关的各种参数，随后还需在规模化条件下验证该工艺步骤的适用性。质粒复合物的表征和复合物形成效率的测定具有不小的挑战性，因为将复合物属性与转染效率联系起来的现有分析方法或者当使用LVV编码治疗性转基因时适合快速测定转染效率的方法有限。
相比之下，当使用基于四环素诱导系统的LVV稳定PCL时，LVV生产的诱导可允许实现更直接的生产操作。这一步只涉及到添加诱导试剂和任何增强剂或添加物，通常在诱导24小时内添加，然后在诱导后大约48小时、达到峰值滴度时，收获载体。诱导步骤和LVV生产阶段的一些参数可以优化，以使产率最大化，工艺残留浓度最小化，包括诱导时的细胞密度、诱导剂/增强剂浓度和收获时间。生产生物反应器参数控制策略的开发，包括pH值、溶氧、温度和搅拌速度，也可以最大限度地提高产量和工艺稳健性。当确定这些工艺参数时，应考虑稳定PCL的生长特性、代谢特性和LVV生产动力学。鉴于诱导单元操作相对简单，使用稳定PCL生产LVV的工艺很容易应用于大规模生产，例如在数百或数千升规模的搅拌罐生物反应器中，并可以简化工艺放大。相比需要形成复合物的工艺，使用稳定PCL还可以减少对设备的要求，并降低微生物污染的风险，因为与复合物形成相比，操作人员的操作更少，所需的材料也更少。此外，考虑到这些细胞系的单克隆性以及没有可变的瞬时转染步骤，稳定PCL提供了降低批次间可变性和更高的工艺稳健性的潜力。
虽然已经在制备高产量LVV稳定PCL和LVV上游工艺规模放大方面取得了显著的进展，在降低每批次LVV商品成本、提高每批次的质量、降低批次间的差异以及进一步提高工艺理解方面，还有很多其它机会。上游LVV工艺的开发可以通过提高工艺产量、降低批次时间、减少收获时可转移至下游工艺的残留浓度，以及实施过程中分析技术(PAT)，来帮助实现这些目标。
工艺强化可以降低批次持续时间，从而降低每批所需的工厂时间，继而提高产能并降低运营成本。此外，通过制备高细胞密度来减少在细胞培养瓶中的传代次数，以及适合解冻和随后以封闭方式接种生物反应器的细胞库体积，不仅可以降低微生物污染的风险，而且还可以缩短工艺时间。基于灌流的系统的实施，如交替式切向流过滤(ATF)或切向流过滤(TFF)，已被证明可大大提高单克隆抗体生产的活细胞密度和产物产量。最近，这种技术被评估用于以HEK293稳定PCL生产慢病毒载体，与批次工艺 (6.9 x 10^9 TU/L)相比，灌流工艺 (8 x 10^10 TU/L)累积产量增加了1log以上。因此，灌流工艺的实施有可能大幅降低LVV生产相关产品的成本，并以更小的批次规模，获得更高的工艺产量。在生产生物反应器步骤中引入灌流技术可能更适用于使用稳定PCL的上游工艺，因为在较高的细胞密度条件下，瞬时转染后可以观察到较低的特异性产率，且高细胞密度瞬时转染所需的质粒量更高。此外，灌流工艺的实施提供了开发连续的上游和下游工艺的可能性。然而，对于LVV的生产来说，这还有待建立，因为需要克服一些重大的挑战。例如，在上游工艺过程中，为了实现连续工艺而延长高活性细胞培养和LVV生产可能会产生障碍，特别是当稳定PCL组成性表达细胞毒性序列时。此外，还需要采用适当的技术进行连续的细胞截留和LVV收获，并且必须考虑灌流/连续的上游工艺对下游工艺可能带来的更高污染水平的影响。
新型培养基配方和补液策略的开发为提高批次、补料分批和灌流工艺中的细胞生长、细胞活性的维持以及LVV产量的优化提供了可能性。近年来，行业已经开发和优化了一系列用于病毒载体生产的化学限定、商业化可用的培养基配方。然而，这些工作通常侧重于基于瞬时转染的病毒载体生产，即将质粒DNA递送到宿主细胞系。需要了解每种LVV稳定PCL的代谢特性，以便针对这些细胞系开发优化的培养基配方和补液策略。为了了解HEK293细胞在病毒生产过程中的代谢特性，并确定针对添加物 (如脂类、胆固醇、糖、维生素) 的目标代谢物，已经进行了大量研究。此外，已知一些小分子可以增强HEK293细胞系中慢病毒的生产，例如，组蛋白去乙酰化抑制剂和咖啡因。继续进行此类实验，以鉴定稳定PCL的新型补液和LVV生产增强剂，可进一步提高感染性滴度，降低LVV生产的商品成本。对于鉴别出的每一种候选LVV生产增强剂，都应考虑分子的安全性，评估分子在下游工艺过程中的清除度，并调查适合在GMP生产工厂中使用的材料的采购。
用于生成稳定PCL的宿主细胞系工程也代表了一个特定的领域，在最大限度地提高细胞活性和LVV生产率，并最大限度地减少上游工艺过程中污染物的存在方面，可以取得重大进展。例如，通过抑制促凋亡基因，通过转基因抑制，通过调节病毒出芽途径，以及通过分泌核酸酶。
用于LVV生产的瞬时和稳定PCL上游工艺表征的工艺分析技术的开发，对于工艺优化和关键质量属性的监控也至关重要。此类近线或在线技术的实施可允许监测活细胞密度、监测关键代谢物的积累或消耗、优化和自动化补液策略，以及量化上、下游工艺中的污染物水平。此外，这些工具可以量化感染性和非感染性病毒颗粒的数量，并优化收获的方法和时间，以最大限度地提高LVV产量。电容，或介电谱，是一种可以用于克服这些挑战的技术，因为它已经被证明适合监测细胞生长和病毒生产动力学。拉曼光谱、在线高效液相色谱(HPLC)和在线质谱也代表了潜在的解决方案。这些发展将代表LVV生产过程中控制的一个步骤变化。
原文：P.Archibald, A.Shillings, Enabling development of commercial-ready lentiviral vector manufacturing processes using stable producer cell lines. Cell & GeneTherapy Insights, 2021.
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