rAAV基因疗法快速制剂开发的分析工具包 - II
本文节选自来自Ultragenyx的研究人员发表的文章“Analytical toolkit for rapid formulation development of rAAV gene therapies”，由于水平有限，详细内容，请参考原文或往期推送“rAAV基因疗法快速制剂开发的分析工具包 - I”。
亚可见颗粒性杂质
基因治疗领域尚未有大量研究文章发表的一个聚集领域是药物产品中的亚可见颗粒 (SVP)。尽管通过静脉输注药物的系统性递送方式涉及大量的稀释和过滤操作，可以最大限度地降低将SVP输送到患者体内的风险，但直接递送到局部组织的风险可能较高。根据USP<789>眼科中的颗粒性物质，靶向视网膜组织的治疗药物，以及按照USP<788>所列，递送到其它组织的确定限制的颗粒计数为≥25 μm和≥10 μm。此外，监管机构还希望药物开发人员能够监测和控制2 -10mm颗粒并监测~1μm或以下的颗粒。
如前所述，DLS可以检测1-2 μm的聚集。对于≥2 μm的颗粒，两种标准方法，光阻法和显微镜法，在<787>、<788>和<789>指南中已经给出建议。这两种用于rAAV基因产物分析的SVP检测方法的实施受到了样品体积需求较大 (1-25 mL) (<788>) 的阻碍，使它们不能作为rAAV制剂研究的常规方法。该领域最近的技术进步将样品需求降至了3 μL至150μL，包括自动显微镜(HaloLabs)、通过光吸收和散射的单颗粒光学尺寸检测 (Entegris的AccuSizer®) 以及库尔特计数 (SpectraDyne™)。自动显微镜和AccuSizer是自动化和快速的方式，而SpectraDyne库尔特计数从一种手动且低通量的方法。自动光谱学(HaloLabs)采用96孔板形式，通过自动成像消除了主观误差，提高了准确性，适合应用于基因治疗领域。
我们对自动显微镜的初步评估显示，在rAAV制备液中SVP≥2 μm可能会因高温、低pH和高剪切等不同应力因素而增加(图1)。颗粒数的精确性在误差条中表示，类似于目前的标准SVP方法。颗粒的行为通过其宽度(直径)和高度(SIM强度)进行三维测量。针对应力的反应的特定模式表明，该技术将对药物制剂的评估非常重要。
病毒蛋白比例 & 蛋白质杂质
三种VP 的平衡（VP比例）对于正确的结构/形状和功能是必需的，而产品相关的VP杂质是一个临床安全问题。每种VP都有特定的生物学功能 (VP1指导细胞运输和核内体逃逸，VP3形成正确的形状)，而不适当的比例会导致效力降低。由于VP比是一个重要的效力指标，因此在存储期间应保持其一致性。VP杂质，通常是病毒蛋白降解的产物，表明出现不稳定的情况，可能是一个安全问题。在储存过程中，VP比和杂质会受到多种因素的干扰，包括物理和热应力诱导的变性和化学诱导的PTM变化。
SDS - PAGE是经典的电泳方法。它使用数mL的物料，可以进行平行分析。SDS-PAGE的主要问题是定量精度低，浓度动态范围窄。CE-SDS，也被称为SDS毛细管凝胶电泳 (CE-CGE)，在分离分辨率和精度方面比SDS-PAGE更有优势，因为CE-SDS是插入式运动的，最大限度地降低了扩散。这可获得非常窄的峰宽，允许实现可靠的定量和较低的检测限。样品堆积也增加了相对SDS-PAGE的灵敏度。CE-SDS的运行时间只有几分钟。通过自动化设置，大大改善了周转时间。需要注意的是，CE-SDS的敏感性受到高盐浓度的影响，这是由于与分析物的竞争注入和谱带展宽造成的。此外，高水平的特定缓冲液和赋形剂也可能会产生干扰。
脱酰胺 & 电荷异构体
脱酰胺是一个重要的稳定性指示属性，因为它与转导效率的降低和效力的损失有关。脱酰胺作用发生在天冬酰胺或谷氨酰胺失去酰胺基并通过水解转化为羧酸。因此，在稳定性研究中，可以从电荷异构体的变化或蛋白质pI的降低来间接监测。
传统的电荷异构体检测方法是离子交换色谱 (IEC) 或等电聚焦凝胶电泳 (IEF)。但这些方法存在变异性高、分辨率低、精度差的局限性。新一代的毛细管等电聚焦(CIEF)和成像CIEF(iCIEF)解决了这些问题。iCIEF进一步消除了转移步骤，从而在15-20 min的短时间内实现最高分辨率。我们在一项延长储存研究中，使用iCIEF检测了rAAV电荷异构体在同一制剂缓冲液中的变化 (图2)。在图2A中，当样品暴露于更高的温度条件时，显示酸性物质增加。在图2B中，对照样品的pI范围从6.2 - 6.9开始。4天后，样品pI变化为6.0- 6.5范围 (图2C)；同一样品在7天后变化为5.9 - 6.3 (图2D)。iCIEF用于AAV表征和稳定性研究的报道有限。然而，该方法具有高分辨率、开发时间短、样品量低以及运行时间快等优点，在早期制剂开发方面具有巨大的潜力。建议使用iCIEF来比较不同制剂中的电荷异构体变化，因为制剂离子强度可能会影响电荷分布。
翻译后修饰（PTM）
效力和稳定性中的VP比、蛋白质杂质和表面电荷可以通过质谱与结构相关联。近年来，人们越来越热衷于用质谱法来表征一级结构和PTM，以获得结构的关键信息。Jin等开发了rAAV的完整肽图谱方法，并鉴定了关键PTM。VP1 N-端乙酰化和VP2磷酸化在其感染性中起直接作用。N-糖基化可能是rAAV趋向性和VP比的影响因素。在AAV8血清型中观察到了广泛的脱酰胺作用，并与活性损失相关。PTM与结构/功能之间的联系使质谱技术成为下一代制剂开发的关键工具之一。
质谱的两个主要方向并行发展，以支持rAAV产品质量的表征。使用反相高效液相色谱-质谱联用(RP-HPLC-MS)或包括RP-HPLC-MS和CE-MS的病毒蛋白异构体的完整质谱分析的肽图谱进行PTM表征。肽图生成了几乎完整的序列覆盖，在VP1u上生成可信的PTM分配，并基于综合片段和序列变异搜索进行定量。通过适当的优化，肽图每次运行可以使用<10μg的物料，并实现适度通量的实验。然而，肽图分配通常需要复制，包括一个组合，以确保重复性。人工验证和较长的数据处理时间也决定了该方法对制剂开发的适用性程度。由于CE-SDS和iCIEF的功能交叉，CE-MS是一项重要的开发技术。CE-SDS分析的病毒蛋白杂质和VP异构体以及iCIEF分析的电荷特性都可以通过质谱鉴定。CE-MS已被证明能够以充分的信号成功分离VP1、2和3。CE-MS的优点之一是在独立的VP上使用完整的质谱，从而大大减少了实验和分析时间。基于芯片的CE-MS对样品的要求非常低，接近nL的量级，分离和质谱采集只需几分钟。高通量和丰富的信息输出使基于芯片的CE-MS成为制剂开发的理想工具。
rAAV衣壳蛋白残基的特定翻译后修饰可能是生化或热应力的结果，这些修饰与载体产物随后感染性或效力的下降有关。针对导致效力丧失的影响性PTM的全面研究才刚刚开始。这里我们将给出两个例子：脱酰胺和氧化。天冬酰胺或谷氨酰胺脱酰胺可能发生在AAV衣壳蛋白上，而后者与载体的感染性有关，这会导致产品质量的变化。rAAV衣壳PTM的表征可以建立生物功能变化的“先导指标”，因此这在制剂和稳定性研究中非常重要。氧化是制剂开发中需要考虑的一个关键因素。研究表明，EDTA、三乙醇胺和柠檬酸等自由基氧化抑制剂可以增强病毒载体的稳定性。可以用HILIC-FLR-MS检测rAAV的氧化。使用基于芯片的CE与高质量分辨率/准确度质谱仪联用获得的病毒蛋白完整质谱，可以用于估计氧化和脱酰胺。
我们对基于芯片的CE-MS的初步评估显示，在热应力下，AAV9的脱酰胺作用显著增加至约100%，导致平均质量比非应力高1个质量单位。更高阶的脱酰胺产品可以看到~ 20%。这一结果鼓励了基于芯片的CE-MS作为制剂开发的常规工具，以监测PTM的变化。更早发现制剂不能抑制不希望的PTM产生的情况，对于在给定温度下长期保持产品质量是很重要的。
热稳定性
AAV衣壳熔化温度(Tm)是一种表明质量属性的稳定性指标，常与血清型有关。衣壳的脱酰胺或降解可以反映在转变温度的降低上，而Tm可由衣壳中单一的酸性或碱性氨基酸差异而改变的。有报道称，Tm受制剂pH的影响，在pH4.0附近，由于核内体/溶酶体逃逸时VP1u外化和AAV脱壳，Tm下降更快。因此，研究AAV的热转变特性可以选择热稳定赋形剂或优化缓冲液pH条件。
差示扫描量热法(DSC)是一种表征蛋白质热转变的常用技术。它检测蛋白质结构对温度的依赖关系，以随温度的热容函数(Cp)的表示。另一种方法是差分扫描荧光法(DSF)。蛋白质结合染料(通常是SYBRGreen)用于结合蛋白质的疏水区域。当核疏水区暴露，荧光会在蛋白变性阶段显著增强。DNA结合染料，如SYBR gold，也被用于监测基因组在加热过程中的释放。不过，DSC需要较大的样品量，而DSF可能存在缓冲基质干扰，因此两者都不适于早期制剂的开发。
新一代的DSF仪器解决了以前的局限性。NanoDSF具有进样量小(10μL)和高通量(48个样品/ 2 h)的特点，极大地提高了量热实验的能力。它还通过利用蛋白质色氨酸的固有天然荧光(NF)消除了对外部染料的需要。我们使用NanoDSF来比较热应力样品，观察到Cp基线升高以及达到Tm之前早期转变的丢失。然而，NanoDSF不能取代DSF的DNA检测，因为DNA不含固有荧光。
总之，DSF为AAV制剂开发提供了一种快速、经济、可靠的方法。然而，比较不同AAV产品的热转变可能是困难的。热只是导致AAV降解的应力因素之一。据报道，在不同的缓冲液制剂中，单个病毒蛋白的热稳定性对AAV转导效率没有显著影响。Tm可能与储存稳定性有关，因此，可用于选择改善AAV热稳定性的制剂缓冲液，但在早期阶段可能还需要其它效力分析方法来建立相关性。
胶体稳定性
稳定的高浓度rAAV制剂对中枢神经系统给药等一些给药途径具有重要意义。然而，高浓度对制剂的开发提出了物料限制的挑战。rAAV在高浓度下的行为可以通过浓度导致的自我相互作用来研究。自我相互作用，或蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)，在高浓度时尤为显著，并可导致胶体不稳定性，这是使用几个不希望出现的生物物理特性进行描述，包括相分离、悬浮、浑浊和粘度增加，所有这些都与聚集有关。用于PPI研究的工具包括光谱学方法、使用DLS的渗透第二维里系数B22计算和kD分析、zeta电位以及粘度。这种组合被证明可以预测长期稳定性。光谱学中常用的方法包括Octate系列仪器的双分子层干涉法(BLI)，以及结合各种样品制备方法的UV光谱浊度测定法。它们都具有高吞吐量和快速周转的特点。这些方法是相对的，具有比较合理的精度。DLS的高通量和高精度对于kD/B22是必不可少的，前文已经对仪器进行了讨论。粘度必须在高浓度时直接测定。使用少量样品的粘度计包括micro-VISC系列仪器和Viscosizer，后者具有实现高通量方式的自动化能力。zeta电位检测的最新进展现在允许在自然制剂缓冲液中进行精确且高通量的检测（Izon的TRPS）。本文列出了一系列工具的组合，可为在rAAV领域开发高浓度制剂提供条件。
分析方法总结
本文介绍了一系列适用于rAAV制剂开发和稳定性研究的传统和新一代分析工具。下面的表2总结了这些方法的优缺点。DLS、nanoDSF和iCIEF为快速制剂开发以及加速稳定性研究提供了巨大的潜力。
评估PPI的工具尚未充分开发用于rAAV，因此不包括在表2中。本文未讨论的其它分析工具包括直接结构检测和结合分析，可能为制剂的开发提供新的可能性。
原文：J.Y.Wei, Y.Cai, J.Warren, Analytical toolkit for rapid formulation development of rAAV gene therapies. Cell & Gene Therapy Insights 2021; 7(9), 1295–1308.
相关阅读：