用于连续纯化工艺的流体管理策略
本文节选自来自诺华的研究人员发表的文章“Flow management strategies for a connected purification process”，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
简介
在过去十年中，生物制造商面临的挑战之一是难以准确预测市场增长，适应产品销售的变化，并在不产生大量资本投入的情况下迅速实施工艺和生产技术的改进。传统的不锈钢生物生产工厂，生物反应器可达2万升，不够灵活，不能适应各种不同的产品与动态的市场需求。因此，生物制造商一直在寻找解决方案，不仅要满足动态需求，而且要有足够的灵活性来高效地生产多种产品，且无需对工厂进行昂贵的改造。
近年来，生物技术行业开始将连续生产作为一种潜在的解决方案，因为其所需的设备要小得多，因为生物反应器通过灌流可大大提高单位体积产量。通过提高细胞培养滴度，灌流技术可以将生物反应器的尺寸降低到1000-2000升，同时仍然可以实现与大规模补料分批生物反应器相当的质量/生物反应器输出。然而，灌流收获液需要适当管理，以避免大型收获液储罐的使用。为了解决这一问题，已经有开发人员提出了以连续或半连续模式操作的整合式捕获步骤。进一步发展的下游工艺还需要在更小的设备中处理等量的物料，而不依赖于大型缓冲和合并罐。减少所需空间可以通过在更小的缓冲罐中使用浓缩缓冲液来实现。此外，一种连接的下游的工艺将消除对中间储罐的需要。例如，Shamashkin等人建立了一种连接的串联操作，该操作使用Protein A捕获，然后在实验规模条件下进行流穿(FT)模式阴离子交换层析(AEX)和除病毒过滤(VF)。Klutz等人在2015年提出了一种新方法，以10 L生物反应器规模和一个完全连续运行的下游部分生产抗体，后者包括两个FT层析柱，然后是VF和单通过切向流过滤(TFF)制剂。然而，从流体管理的角度来说，完全连续地操作下游工艺仍具有不小的挑战性，因为每个步骤都需要匹配在相同的体积流量条件下，而产品浓度可能会有一个数量级的变化。
本文评估了四种不同的流体管理方法用于连接的下游工艺，其中包括两个精纯步骤、VF和TFF，如图1所示。在这个例子中，两个离子交换层析(IEX)步骤，第一个以结合/洗脱(B/E)模式操作，第二个操作以FT模式操作，将两者连接起来，这样，大型中间罐可以被小型缓冲罐取代，以打破压力。此外，缓冲罐可以匹配系统之间流量的微小差异，并提供混合，以抑制由于B/E层析中的梯度而产生的不期望的蛋白质浓度峰以及pH或电导率极端值。在线滴度检测可以在层析步骤的出口或入口进行。VF后，不需要缓冲罐，因为滤液可以直接收集在TFF系统的回流罐中。
图1. 连接的下游工艺方案。VIN池在结合/洗脱模式下上样到IEX 1柱上。洗脱液直接进入缓冲罐，在短暂的停留时间后，以流穿模式上样到随后的IEX2步骤，而第一根层析柱的洗脱仍在进行中。IEX2流出液再次直接进入缓冲罐，通过除病毒过滤后，在超滤系统中浓缩。两个层析步骤都可以选择调节洗脱液/流出液，以达到后续步骤所需的上样条件。
流体管理策略
实现连接的下游工艺的关键是对单元操作之间的流量差异进行稳健管理。在一个典型的超滤(UF)步骤中，随着物质添加到截留液罐中，产品浓度增加，导致滤液通量下降。对于离散的补料分批UF，进入截留液罐的进样流量减小以匹配滤液流量，以保持恒定的截留液体积。在连接的下游工艺中，入口液流直接连接到先前的单元操作，滤液流量的任何下降都可能导致流量差异。下面提出了四种不同的流量管理方法来管理潜在的流量差异。
1. 回流液位控制。如前文所述，由于通量会随蛋白质浓度的增加而衰减，因此工艺过程中回流液的体积会增加，因此可以调整错流流速(CRF)和跨膜压力(TMP)。为了开发一个稳健的工艺，需要定义这些工艺参数的范围。为了限制对产品的剪切，最好根据历史经验设置最大CRFmax和最大TMPmax。为了保持回流液位不变，系统需要能够在定义的最大错流流速和TMP内达到一定的滤液通量，这对应于前一个工艺步骤(VF)的流入流速。
所需的滤液通量可计算为：
其中Qin为来自VF步骤的流入进样流速，A为总膜面积。通过在先前定义的CRFmax下的TMP探测，可以确定在预期浓度范围内的TMPmax。有了这些参数，通过不同蛋白质浓度下的通量探测，可以确定所需滤液通量Jreq仍可以达到的最高蛋白质浓度。
针对该工艺步骤，使用Cmax、TFF系统的滞留体积VHU以及预估的蛋白质质量mprotein，回流罐的设定点VSP可按以下公式确定：
一旦达到设定点体积，开始UF工艺，检测回流液位。通过调节CRF和TMP，回流液位可维持在设定点。
2. 滤液通量控制。使用该策略时，不是监测回流液位，而是监测滤液通量。CRF和TMP范围如上所述确定，并在过程中进行调整，以使滤液通量保持在与前一个工艺步骤中相应的流入流速相同的水平。
3. 精纯流速控制。在这种方法中，TFF的操作方式与传统的补料分批模式类似，导致滤液通量下降。使用这种控制的目的是调整前几步(层析和VF)的流速，以保持回流液位恒定。一个可能的缺点是，如果操作没有达到最佳状态，之前步骤的效率就会降低。
4. 变化的回流液位。最后一种方法是使用回流罐作为缓冲罐。当前面操作的流速保持不变时，CRF和TMP是固定的，就像在传统的补料分批工艺中一样，因此回流液位将会变化。这样，这个过程不是使用任何主动的控制，而是一种内在的控制。在开始时，回流液中的蛋白质浓度预计会上升，导致滤液通量下降。接下来，滤液通量下降到进料流速以下，罐液位开始再次增加。这种自我调节效应将在以下部分进行评估，并对其挑战进行讨论。可能的缺点是需要一个更大的回流罐，以及管理罐整个下调范围的挑战，以进行混合和温度控制。
TFF系统中的质量跟踪
通过积分最后一个层析步骤洗脱或FT/漂洗过程中的蛋白浓度，可以计算任意给定时间点，回流罐中的蛋白质量。通过280nm处的消光系数ε280nm、UV池光程d以及280nm处的吸光度E280nm来确定浓度。由于280nm处的吸光度通常在峰值处是饱和的，因此可以所用系统内历史数据线性范围(100-1500 mAU280nm)估计的因子g校正后的E300nm来确定E280nm：
材料和方法
材料
TFF使用MWCO 30 kD、膜表面积88 cm2的Pellicon 3 Ultracel膜（Merck）。离子交换填料装于XK26/40柱，总柱体积103.5mL。实验使用AKTA Avant150系统（Cytiva）。TFF通量探查实验在AKTA Crossflow系统上进行（Cytiva）。连接的运行中的TFF在KrosFlo®设备上进行（Repligen）。滤液质量和回流罐质量以重量检测。mAb（145kD）由Novartis以CHO细胞生产。
通量探查实验
使用一块总膜面积为88cm2的Pellicon 3 Ultracel膜包。使用400LMH的CRF。通过改变TMP (开放回流阀/0.2/0.4/0.8/1.5/2bar)和蛋白质浓度(5/15/30/50/70g/L)来收集较宽范围内的工艺参数(IEX 2流出液，LD ~500 g/m2)的数据。以IEX 2的漂洗缓冲作为基质，模拟连接的工艺的类似条件。与没有滤液泵和开放回流阀的系统相比，AKTA Crossflow系统使用集成的滤液泵来获得更低的TMP。由于大多数系统不包括这个滤液泵，由这种设置而获得的结果(例如，实际的TMP低于打开回流阀并关闭滤液泵时的TMP)没有用于评估。
连接的IEX-UF
为了简化实验，只进行IEX 1，洗脱液立即直接进入KrosFlo系统的回流液罐中。第二个精纯步骤和VF没有执行。这被认为是最坏的情况，因为物料没有完全纯化。使用两个Pellicon 3 Ultracel膜包，总膜面积为176 cm2。IEX 1的保留时间(RT)为8.9 min，相应的流速Qin为11.6 ml/min。
使用系统软件监测CRF、TMP和滤液质量数据点 (KrosFlo® KF Comm软件，Repligen)。为了根据重力数据中计算体积，假设在研究的达70 g/L的浓度范围内，密度为1 g/cm3。通过滤液质量数据计算滤液通量，并根据回流罐质量计算回流罐内体积。在达到设定的体积VSP后，完全打开回流阀，以确定的流速启动错流进样泵。
Repligen KrosFlo® TFF 系统
详细的控制方式和实验结果及讨论，请查看原文。
图2. TMP探查的错流流速为400 LMH，蛋白质浓度为30、50、68g/L (未显示5和15 g/L的数据)。测试的TMP分别为开放回流阀、0.2、0.4、0.8、1.5和2.0bar。每条曲线的第一个数据点对应于通过打开回流阀实现的TMP。0.2 bar和0.4bar的结果被排除在外，因为在没有额外滤液泵的情况下，通常在生产规模上无法达到该条件。在0.8bar条件下的浓度范围内发现了一个很好的拐点，定义为TMPmax。
图3. 在0.8 bar TMP和400LMH错流流速条件下，滤液通量与蛋白质浓度的关系。要保持在所需的39.5LMH的滤液通量内，可达到的最大蛋白质浓度测定约为48g/L。
图4. 采用回流液位控制方法使回流液体积恒定。TFF工艺参数(CRF(左轴)，TMP，回流液罐体积V，滤液通量J)和估计的蛋白浓度c(右轴)按时间绘图。CRF稳定增加，以保持保持回流罐液位不变。由于没有达到400 LMH的最大错流流速CRFmax，因此在实验过程中保持回流阀全开。由于蛋白质浓度的升高，TMP持续增加。回流液罐的液位是恒定的，在设定值±1%范围内。
图5. 通过滤液通量控制方法实现恒定回流体积。TFF工艺参数(CRF(左轴)，TMP，回流液罐体积V，滤液通量J)和估计的蛋白浓度c(右轴)按时间绘图。稳定地增加CRF以保持滤液通量恒定。将最大错流流速CRFmax降至314 LMH，测试通过回流阀进行滤液通量控制。这发生在大约16分钟后。TMP进一步增加到0.88bar以控制滤液通量。滤液通量平均保持在38.4LMH附近，范围在32.9 ~ 45.3LMH之间。回流液罐液位是恒定的，在其初始值±5%范围内。
图6. 通过精纯流速控制方法来保持回流液体积恒定。IEX洗脱流速Qelution和TFF工艺参数(CRF(左轴)、TMP、回流液罐体积V、滤液通量J)和估计的蛋白浓度c(右轴)按时间绘图。CRF固定在300 LMH，回流阀保持完全打开。调节IEX洗脱流速以保持回流液罐的液位不变。在开始时，回流罐的液位迅速下降，需要提高IEX流速。当浓度回到设定值后，随着滤液通量在整个浓缩步骤中不断下降，洗脱流速不断降低。
图7. 变化回流液体积方法。TFF工艺参数(CRF(左轴)、TMP、回流液罐体积V、滤液通量J)和估计的蛋白浓度c(右轴)按时间绘图。CRF固定在400LMH，回流阀保持完全打开。IEX步骤的流入流速保持不变。由于工艺开始时系统中蛋白质浓度较低，滤液通量较高，导致回流液罐液位降低。随着蛋白质浓度的增加，滤液通量不断下降，回流液罐液位开始上升，直到实验结束时接近回到设定值。TMP在整个实验过程中持续增加。
表1. 各种控制模式的潜在风险、失败原因和缓解方案
模式 | 风险 | 失败 | 缓解方案 |
所有模式 |
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精纯流速控制 |
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变化回流液位 |
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总结
一个连接的下游工艺可以为管理一个小型生产工厂内产品合并体积提供解决方案。这种替代操作方式带来了技术可行性方面的挑战。由于合并罐被小型临时罐所取代，所有步骤的流速校准是必要的。本文研究提出了不同的流速管理策略。
可变的回流体积方法及其内在控制在使用一种特定的mAb时获得了成功，但可能会在其它生物产品的操作中带来问题(如更高的粘度)。潜在的风险包括回流罐的排放以及不充分的混合或温度控制。这可以通过将滤液流循环返回至回流罐来缓解。由于缺乏对过程的控制，这种策略不是作者的首选选择。调节上游步骤的流速是一种替代解决方案，但如果分辨率受到影响，它可能会显著降低层析性能，甚至影响产品质量。此外，VF的性能和除病毒过滤器的完整性可能受到高流速和由此产生的压力的影响。出于这些原因，作者也不推荐这种策略。
恒定液位和/或恒定滤液通量控制似乎是生产过程中更可靠的选择，因为滤液通量和/或回流液罐内液位可以通过在确定范围内操纵CRF和TMP而进行控制。因此，对于预期进入UF系统的来料流速，需要确保流速的差异可以管理，同时通过限制CRF和TMP至可接受的值，来避免剪切应力或高压。如果工艺完全在设计空间内，就可以控制任何流速变化，而不需要对其它工艺步骤(如层析或VF)进行调整。因此，这两种操作策略，恒定液位和恒定滤液通量控制，似乎更可行和可靠的生产工艺。
原文：Goebel, M.,Rodrigues, R., Pampel, L.,Rapp, J., Shultz, J., & Cui, H. (2021). Flowmanagement strategies for a connected purification process. Biotechnology andBioengineering, 1–8. https://doi.org/10.1002/bit.27772.
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