CHO细胞的灌流培养：参数优化
本文节选自“Perfusion culture of Chinese Hamster Ovary cells for bioprocessing applications”，由于水平有限，详细内容，请参考原文或往期推送“针对生物工艺应用的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞的灌流培养”和“CHO细胞的灌流培养：系统配置”。
参数优化
温度和pH
众所周知，在生物工艺的生产阶段，温度的降低会使代谢更有利于产品生产，而不是生物质的累积。这已被应用于灌流培养，许多研究表明，当温度降低到31-34℃时，在不牺牲活性的情况下，可提高特异性产率和产量。这种现象与细胞周期的阻滞有关，灌流培养可以在温度变化后的短短3天内达到假稳态。在培养过程中，将pH设定点从7.1降低到6.8也被证明可以提高传统补料分批培养的活性和生产力。在灌流培养中，pH值的类似变化与产品糖基化和生物疗效的改善有关。然而，由于pH和温度降低策略往往会降低细胞的生长速度，这些策略可能会缩短培养的持续时间，或者需要在不同的设定点进行产率和生长循环。这项研究可能会受益于之前旨在预测温度变化的长期影响的补料分批工作流。
灌流速率
灌流方法的定义特征是连续地注入新鲜培养基并去除无细胞的收获液。这导致与补料分批工艺操作相比，培养基消耗大幅增加，这对工艺放大和成本有重大影响。保持系统的低灌流速率不仅是为了减少培养基的使用，而且也是为了使传递到下游单元的料液体积最小化。因此，最低CSPR在技术和经济上都是一个关键参数。最低CSPR可以通过规模缩小系统或通过增加细胞数量或降低稀释率在生物反应器设置中进行评估。最低CSPR可以用来维持生产的假稳态，然而，它与培养基组成和细胞系有很大的关系。随着可用的在线生物质监测设备的商业化，有可能以恒定的CSPR为目标，并根据生物反应器内的细胞调整灌流速率，最大限度地减少未利用的营养物被作为废液流出反应器。也有研究已经证明，有意地降低CSPR可以有利于将细胞从生物质转向产物生产。
培养基优化
培养基优化是参数优化中最通用的领域，因为在标准配方中存在“无数”的成分。培养基性能不仅与较低的CSPR有关，还与优化的培养动力学有关，因此，对工艺经济性有直接的影响。在补料分批工艺作为平台选择的很长一段时间内，大多数培养基配方已经相应地得到优化。利用这些先前开发的培养基并将其调节用于灌流培养一直是一种常见的方法，特别是自2017年以来。
通过运行多个独立的灌流工艺来测试培养基配方需要消耗大量的资源。而DoE软件和初步批次测试的使用被证明是鉴别补料分批培养基和补液培养基的有益组合的强大工具。然而，组合使用已开发的培养基配方的缺点是保留了冗余成分。通过将进料分批培养基剥离到其最小成分，然后根据代谢需求添加营养物质，有可能创建高效的、针对灌流的培养基。
葡萄糖作为大多数培养基配方的核心碳源，在限制条件下供应可显示出有利的效果，包括提高生产率、产品质量和生物质积累。有趣的是，通过添加丁酸，也观察到类似的代谢反应和生产力的提高。丁酸钠已被用于提高CHO细胞的生产力，包括在灌流期间，但这种方法受到细胞毒性效应的阻碍。其它短链脂肪酸，特别是缬草酸和戊酸，也被用于类似的效果，限制生长条件但刺激生产力。其它利用细胞周期阻滞来提高产量的方法包括改变钠 - 钾比，添加基于小分子的细胞周期抑制剂，或限制关键氨基酸，如天冬酰胺。PluronicF68是一种用于保护细胞免受剪切影响的添加剂，已被证明可通过减少细胞碎片和过滤器污染，而有利于灌流培养基。
随着硬件的到位以及大规模、商业可行性灌流工艺的良好前景，灌流特异性工艺参数的优化和调节是该领域发展的一个合乎逻辑的步骤。培养基作为主要的成本“贡献者”，自2017年以来备受关注。我们预测，这些工作将继续主导研发势头，并在不久的将来带来更多的新发展，目标是实现与大规模补料分批相比，更具有经济优势的CSPR。
与补料分批比较
当在同等条件下进行比较时，灌流工艺的VCD可比批次工艺高2 - 5倍，且维持该密度的时间更长，进而获得更高的单位体积产量。灌流工艺的假稳态、连续性质也允许对培养环境进行更大的控制，这已在蛋白质组学和代谢组学分析中得到了印证。糖基化特性和电荷异构体在灌流工艺中也更加一致，从而可以有效地建模产品质量和糖基化特性。然而，这些产品质量属性变化的相对细微之处以及监管要求的严格程度，可能导致研究报告的是可比的产品质量，而不是任何改进或变化。对于更复杂的产品，灌流工艺可以减少不利的方面，如聚集和不完整的产物片段。药品生产中的一个关键因素，批次间的异质性，也减少了。因此，相比补料分批工艺，灌流工艺在产品数量和质量方面都可实现显著的提升。
然而，由于该工艺中培养基消耗的增加，特异性生产力是比直接的产量更好的性能指标。对此，不同研究的结果各不相同，大约相同数量的研究表明，会出现减少或同等增加的特异性生产力。最近的一项综合研究表明，特异性生产力取决于细胞系，这可能可以解释这些矛盾的结果。另一项具有里程碑意义的研究最近也表明，针对灌流的工艺优化可以使灌流的特异性生产力从最初低于补料分批的结果提高到优化后的更高水平。因此，尽管之前的研究会有相反的结果，但近年来广泛的研究表明，细胞系选择和工艺优化可能使灌流工艺在特异性生产力方面超过补料分批工艺。
灌流工艺延长的时间也应根据其它操作成本进行评估。虽然培养基确实大大增加了整个工艺的成本，但灌流工艺也产生了更大的环境足迹，因为公用设施的消耗，尤其是水。然而，这种评估是特定于工艺的，并且可能只适用于已过渡到一次性使用技术的现有工艺。然而，最近的研究表明，在具有相似的特异性生产力的情况下，当对产量应用杠杆时，灌流工艺的培养基成本甚至比补料分批的成本还要低。这是由于灌流工艺在最佳的细胞密度下运行的时间更长。进行完整过程分析的研究得出了不同的结论：有的倾向于补料分批，有的倾向于灌流，亦或者发现最终成本的差异相当微小。有趣的是，截留装置的选择被认为是总成本的一个重要因素，而采用ATF的研究比使用重力沉降的研究表现得更好。
除了所用的截留装置，在生物反应器规模和整体工厂占地方面，灌流工艺的内在强化也促进了显著的灵活性。这是建立在前面提到的一次性生物反应器技术的进步之上的，其也提供了建设超小规模商业化设施的可能性，这些设施的物理占地面积仅为传统生产工厂的一小部分。这一理念甚至导致了商业化即插即用工厂的开发，即模块化工厂。
原文：M. A. MacDonald, M. Nöbel, D. R. Recinos, et al., Perfusion culture of Chinese Hamster Ovary cells for bioprocessing applications. Critical Reviews in Biotechnology, 2021, https://doi.org/10.1080/07388551.2021.1998821.
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