通过膜技术整合下游单元操作
本文节选自“Intensified Downstream Processing of Monoclonal Antibodies Using Membrane Technology”，由于水平有限，详细内容，请参考原文或往期推送“使用膜技术强化单克隆抗体下游工艺”和“使用膜技术强化mAb下游工艺：捕获、精纯 & 制剂”。
通过膜技术整合下游单元操作
对具有更高灵活性、经济性、更低占地面积以及一致产品质量的强化下游工艺的需求，推动着生物制造商向工艺整合和连续工艺方向发展。出色的液流特性，加上它们在不同单元操作中的广泛应用，使得膜技术成为实现整合式下游工艺的潜在选择。此外，整合完全采用一次性使用技术的、基于膜的单元操作可能可提高工艺通量，并减少占地面积。本节将介绍把基于膜的单元操作整合到半连续和连续工艺中的各种方法。
以连续模式操作膜吸附
由于在更高流速下的可操作性，如图1C所示，膜层析与先进的连续层析系统(如周期性逆流层析(PCC)和模拟移动床(SMB)层析)相结合，可以潜在地提高纯化工艺的整体生产力。此外，膜层析装置产量的提高可以弥补其固有的低结合载量。表2总结了几项在连续模式下操作膜层析装置以强化下游工艺的研究。
图1. 商业化批次mAb纯化工艺与理想的mAb整合式纯化工艺的比较。A)典型的、基于填料的批次纯化工艺，采用基于填料和基于膜的单元操作。B)理想的整合式mAb纯化工艺，基于填料和基于膜的单元操作以稳定连续模式与灌流生物反应器串联，其很少或没有中间储罐、在线样品调整工具，其具有更低的工厂占地面积。C)完全整合的、基于膜的端到端纯化工艺，膜吸附以稳态连续模式与灌流生物反应器串联，以提高工艺的整体生产力。
表2. 在强化的下游工艺中使用的膜层析装置
目前膜层析连续模式的研究重点不仅限于纯化mAb，还包括具有挑战性的蛋白质和模式分子。Hardick等首先在一个由BSA和细胞色素c组成的非mAb模型上评估了将连续工艺与膜层析相结合的概念。他们使用基于纳米纤维膜吸附的连续工艺，与基于填料的批次工艺相比，生产率提高了15倍。膜吸附还优化了污染耐受性和液流分布，在不降低结合载量和分离性能的前提下，实现了>225次的结合-洗脱循环。Brämer等评估了使用Sartobind Q膜分离由BSA和溶菌酶组成的模型蛋白混合物的4膜吸附PCC。如图1C所示，使用四膜吸附将四种膜的总载量利用率提高了20%。尽管上述研究使用了非mAb的模式分子，但就评估的工艺参数和开发策略而言，所获得的见解最有可能在mAb纯化中得以实现。Zobel等整合了具有不同化学材质的两个不同层析步骤：SartobindS和Sartobind P，使用内部开发的数学模型，来纯化IgG 1型mAb。实验评估了三个不同的案例研究，每一个代表从20到2000 L的生物反应器规模。他们的工作表明，连续膜层析可以将膜载量利用率提高71.5%，生产率提高48.5%，并将洗脱缓冲液的消耗降低38%。
以直通纯化模式操作膜吸附
连续层析操作的另一种变体是直通纯化(straight through purification，STP)，它将一个或多个层析步骤串联起来，通过在线调整和标准化流速来匹配后续层析步骤的最佳上样条件。图1C代表了一个实际场景，其中，整合的、基于膜的连续工艺从一个典型的批次工艺改编而来(图1A)。然而，在STP工艺的情况下，复杂的仪器和多阀系统可以被消除，为高效、经济地整合式连续或半连续工艺提供了一种简单的方法。一个理想的、连接两个流穿层析步骤的STP工艺设计，可以消除中间储罐以及调节pH值和电导率的需要。Yamada等开发了一种mAb纯化工艺，其包括一系列深层过滤单元操作，完全以流穿模式运行。最终HCP水平 <100 ppm，HMWS水平<5%，与mAb纯化平台工艺的纯度相当，同时减少了40%的工艺时间。Trnovec等比较了三种商业化膜吸附 (NatriFlo、Sartobind和Mustang)以流穿模式运行时去除mAb聚体和HCP的性能。他们优化的工艺包括一个AEX膜和一个CEX膜，两者都以流穿模式运行。他们的方法可以使HCP含量降低95%，聚体含量降低到0.4%。Ishihara等使用基于填料的无柱工艺纯化mAb，该工艺包括活性炭膜(Stax Depth Filters-Seitz AKS1 Media)和AEX膜(QyuSpeedD)，两者均以流穿模式操作。该工艺实现了>3 LRV的HCP清除，最终纯化的蛋白质具有与基于填料的Protein A柱相当的粒径异构体水平。
通过单通过切向流过滤实现端到端整合式工艺
工艺强化的一种方法是将现有的、基于填料的mAb纯化平台(图1A)转换为整合的端到端连续工艺，并连接到稳态灌流生物反应器(图1B、C)。工艺整合可以通过组合不同的连续流技术来实现，如在线pH/电导率调节、连续层析系统(PCCC和SMB)、膜吸附以及单通过切向流过滤(SP-TFF)系统。如图1C所示，将批次工艺转换为基于膜的纯化链，可以通过提高生产力和一次性使用选项，进一步增强连续工艺的优势。将批次工艺转化为基于填料或基于膜的整合式工艺的一个共同因素是连续过滤技术的应用，如图1B和图1C所示，比如ATF和SP-TFF。
SP-TFF是一种特殊的技术，在蛋白质溶液的连续在线浓缩和以连续模式整合下游单元操作方面获得了广泛的应用。在SP-TFF中，蛋白质溶液以单次循环的方式通过系统，而在TFF系统中，蛋白质需要多次循环来实现浓缩和缓冲液置换。SP-TFF系统消除了中间性循环罐(用于存储过程中间体)，减少了洗滤缓冲液的使用。最近，Rucker-Pezzini等开发了一种基于SP-TFF的在线洗滤系统，该系统已成功整合到200L中试规模连续下游工艺链中，用于纯化mAb。单通过UF/DF实现了99.8%的缓冲液置换，减少了1.5倍的缓冲液使用。
SP-TFF作为一个介于澄清和中间体纯化步骤之间的连续浓缩步骤，也引起了人们的兴趣。Arunkumar等研究了3阶段SP-TFF作为CHO细胞澄清收获液在线浓缩工具的可行性。他们使用30kda超滤膜，评估了含有四种不同mAb和一种Fc融合蛋白的收获液的浓缩。当SP-TFF与吸附性预过滤器结合时，最大限度地减小了进样压力和TMP的波动，从而提高了工艺的稳健性。浓缩因子达到3.4~ 5.6，HCD实现1.3 LRV。Dizon-Maspat等使用3种不同的mAb对SP-TFF作为中间产品流的在线浓缩步骤进行了评估。在所有评估的情况下，SP-TFF能够在所有工艺参数(跨膜压、进样压力和截留液流速)均在预期范围内，且对产物质量没有任何影响的情况下，将蛋白质样品从10浓缩到133 g/L。这项工作证实了在工厂中采用SP-TFF操作、且只进行最小的修改的可行性。
原文：S.Nadar, G.Shooter, B.Somasundaram, et al., Intensified Downstream Processing of Monoclonal Antibodies Using Membrane Technology. Biotechnology Journal, 2021, DOI:10.1002/biot.202000309.
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