现代化灌流工艺的赋能技术
本文节选自来自Amgen的研究人员发表的文章《From Chemostats to High-Density Perfusion: The Progression of Continuous Mammalian Cell Cultivation》，由于水平有限，更多详细内容，请参考原文或往期推送“工艺强化中的灌流应用”。
推动现代化灌流工艺兴起的关键技术进步主要在于三个方面：细胞系工程、细胞截留技术的发展以及工艺强化。为了使灌流工艺能够持续且经济地运行，技术的进步是由确保更长培养期间细胞稳定性的需求所驱动的，旨在提高细胞截留装置的可放大性、效率以及在更高细胞密度条件下的稳健性，最后，与在现有生产基础设施上运行的补料分批工艺相比，工艺强化可提高经济吸引力。
细胞培养技术的第一个主要进步是培养基和补液策略的结合，旨在提高细胞培养性能和生产力。化学限定培养基通过去除血清间接地使大规模灌流成为可能。血清的去除不仅消除了传染性海绵状脑病和牛海绵状脑病(TSE/BSE)的风险，降低了批次间的差异性，而且在操作上从生产供应链中去除了昂贵且有限的动物源性原材料。新一代的培养基同样围绕CHO代谢设计，以最小化或平衡抑制性副产物的形成，提供更长的培养时间和更高的生产力。例如，最近有研究表明，通过去除基础培养基中的非必要培养基成分，增加重要成分的培养基深度，重新平衡关键氨基酸浓度(Gln、Asp、Asn、Glu)，可降低乳酸和氨副产物的形成。
总体而言，培养基和补液策略开发的努力推动了培养性能的显著改善，包括更高的生产率和活细胞密度。从1985到2020年，上游工艺的平均滴度从0.22 g/L上升到了3.10 g/L。仅在2006至2014年期间，上游平均滴度就从1.64 g/L增加到了2.56 g/L。最近，一些公司已经证实，在保持产品质量的同时，灌流工艺可以在14天内将单位体积产率提高到6 g /L-d。与使用相同细胞系的补料分批工艺相比，这代表了高15倍的总原料药产量。同样，灌流可获得达10^8 cells/mL的高活细胞密度。
细胞截留装置开发用于消除恒化器操作固有的低效性，即细胞损失。最近，更高活细胞密度 (提高单位体积产量的杠杆) 的进展重新引起了人们对细胞截留装置的兴趣和技术发展，以满足在效率和可放大性方面的生产要求。目前的细胞截留装置包括错流膜过滤器、旋转滤器、倾斜式沉降器、连续流离心机以及超声波分离器。现代化的过滤方法，如切向流过滤(TFF)和交替式切向流过滤(ATF)被更常用于灌流工艺，与离心相比，其操作过程中的剪切更低。然而，随着时间的推移，过滤器会因为污染而效率降低。ATF可通过一种自清洁机制来缓解污染的形成。TFF和ATF的一个主要优势是，可根据生产规模调整膜面积或过滤器数量，从而很容易地实现规模放大。离心是另一种常见的技术，其效率受到固体成分沉降速率的影响。对于碟片式分离器，沉降效率与进样料液中固体体积百分比成反比，但考虑到其复杂性，通常仅限于中试规模的工艺。另一种技术，超声波声学沉降技术，在灌流速率达200 L/d的条件下，8天内能够以97%的效率分离细胞，而不影响细胞活性，可在活细胞密度~10^7 cells/mL，工作体积为100 L的条件下操作。
细胞系的开发在连续生产中发挥了重要作用。通过将信号肽添加到转基因序列中，可基于哺乳动物分泌系统，利用细胞截留装置连续收获产物。这不仅是简化纯化的关键里程碑，限制了进入纯化过程的宿主细胞蛋白和细胞碎片的数量，而且实现了上游和下游工艺之间的端到端工艺整合。
生产力的提高是细胞系开发工作的一个标志，有助于使灌流工艺在经济上与补料分批工艺相比具有竞争力。通过启动子选择、序列和载体工程，已经实现了生产力的提高。例如，与SV40和RSV-LTR启动子相比，人类巨细胞病毒(hCMV)启动子在许多哺乳动物细胞系中表现出明显更高的生产力。其它强大的天然启动子包括EF-1α和GAPDH。此外，合成和工程启动子提供了更多提高生产力和克隆长期稳定性的机会。Kozak序列强度的修饰也被证明可以改善产物组装和质量，从而间接提高整体生产率。
理论上，灌流工艺可以“无限”进行，但实际上，细胞会随时间变化。高产细胞系会经由甲基化、组蛋白去乙酰化以及基因拷贝数丢失导致的转录沉默的增加而抑制产量，响应不断提高的生物合成负担。施加选择压力可以帮助保持表达；然而，去除之后，生产率可能很快就会下降。通过限制甲基化依赖性基因沉默，hCMV启动子的胞嘧啶突变可提供更持久的生产力。其它对抗转录沉默的方法包括添加载体和转基因修饰，如边界元件、间隔区和骨架附着区，其可增强转录可及性，并作为间隔区防止染色质过度凝结和压缩。
基因扩增一直是产物表达最大化的基础。转基因整合后，对于基于二氢叶酸还原酶(DHFR)和谷氨酰胺合成酶(GS)的选择系统，分别添加低水平的甲氨喋呤(MTX)和蛋氨酸亚砜亚胺(MSX)，可以通过细胞分裂期间发生的低频扩增事件驱动转基因拷贝数的增加。DHFR选择系统的细胞特性显示，高生产力与DHFR表达正相关。基于系统的方法也揭示了转基因整合后，CHO可以进行整体细胞适应，其中许多有利于蛋白表达。总而言之，这些工作和其它许多工作的成果使总产量在近年来提高了近100倍。
快速生长细胞系的另一个共同特征是由于CHO细胞的遗传流动性造成的基因组重排。CHO细胞系可进行核型和基因重组。这种现象会导致表型和基因型的群体异质性。解决这些挑战的基石是确保生产细胞系的克隆性。传统的方法包括有限稀释和单细胞分选技术，如FACS。目前，纳米流和光电定位等新兴技术正被用于细胞系开发的高通量形式，以确保克隆性，并帮助确保具有最佳产品质量和生产率的克隆能够更好地用于生产。
原文：H.E.Wong, C.Chen, H.Le, et al., From Chemostats to High-Density Perfusion: The Progression of Continuous Mammalian Cell Cultivation. Chemical Technology and Biotechnology, 2021, https://doi.org/10.1002/jctb.6841.
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