使用膜技术强化单克隆抗体下游工艺
本文节选自“Intensified Downstream Processing of Monoclonal Antibodies Using Membrane Technology”，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
膜工艺是单克隆抗体(mAb)下游纯化的一个重要方面，结合基于填料的层析而形成一系列的单元操作。传统上，膜被用于生物工艺中基于粒径的分离，如细胞培养澄清、缓冲液过滤、除病毒、生物负荷降低、超滤和洗滤(UF/DF)等操作。由于过去几十年来聚合物化学和膜支撑基质的发展，现代化的膜产品已经被设计成具有良好的选择性，可以实现基于分子量、表面电荷和疏水性的分离，结合了膜的高通量优势和基于填料的层析技术的分离性能。这扩大了膜去除工艺和产品相关异构体的适用性。然而，与基于填料的工艺相比，基于膜的端到端工艺的商业化实施仍有不小的挑战性，其主要局限性在于可放大性受限、分辨率低、选择性差、结合载量低以及液流分布不均匀。
近年来，在强化生产高价值分子(如mAb)的工艺中，取得了巨大的进展。尽管不同的细胞系，如CHO(中国仓鼠卵巢)、NS0、Sp2/0和杂交瘤被用于mAb的重组表达，但自1986年第一个在CHO中表达的重组生物药获批以来，70%的mAb表达都是采用CHO细胞进行的。得益于细胞系的改进和工艺的优化，基于CHO细胞的上游工艺的产物滴度据报道已可高达13 g/L，细胞密度高达200 x 10^6 cells/mL。生产效率的提高伴随着工艺和产品相关杂质和异构体的增加，继而导致了下游工艺的挑战。据估计，将滴度从1提高到5 g/L，将使下游工艺成本从总体制造成本的61%增加到91%。此外，传统的下游工艺设计为每批次处理5-10 kg mAb，而下游工艺步骤现在需要每批次处理15-100 kg mAb的能力。处理如此大量的产品的挑战在于，基于填料的层析操作由于带增宽和峰稀释，最大层析柱直径限制为2.0- 2.5 m。除了技术上的挑战，大型层析柱可能还会导致实际的挑战，如增加的缓冲液要求，更高的设施占地面积以及资本支出。因此，行业正在评估膜技术，以克服与上游生产力提高相关的下游挑战，并实现下游强化。
膜技术提供了操作的灵活性和实施的简便性，因为它可以作为一次性使用。一次性使用技术减少了小型公司和合同制造商的初始资本投资，后者通常会致力于快速规模放大并生产多种候选药物，且有加快转换以及消除大量清洁操作的要求。一旦产品专营权接近到期，创新药开发商也将面临来自生物仿制药生产商越来越大的竞争压力。采用一次性使用技术所涉及的耗材成本可通过快速实施和对市场需求的灵活响应来平衡。此外，由于它们在各种条件下的可操作性，基于膜的工艺可以是连续或半连续方式操作的可行选择。
本文的目的是提供膜技术在mAb生物工艺中应用的主要进展的更新，并特别强调膜技术在开发强化的端到端生物工艺中的作用。本文将综述膜技术在澄清、捕获、中间体纯化、精纯和制剂单元操作方面的应用进展。
用于下游应用的膜技术的进展
澄清
上游生产力的提高导致了细胞生物量水平的提高 (高达10%v/v ) 以及可溶性和不可溶性杂质的高水平，因此，需要一个强健的澄清步骤，以减少可溶性和不溶性杂质，限制对后续层析和过滤步骤的负担。然而，在高细胞密度(>30× 10^6 cells/mL)条件下，离心或者对细胞培养液进行絮凝预处理等技术受限于收率损失、可放大性、絮凝剂去除和药物安全性等问题。在过去的20年里，膜化学和表面形态的发展已经使深层过滤器在很大程度上取代了离心分离法，包括从小规模反应器收获液到高达2000L的体积。用于澄清的膜技术的类型或形式取决于上游工艺的操作模式。
补料分批工艺的澄清
由于其在高滴度、一致的产品质量、可放大性以及可随时转移到多个设施(包括合同制造组织)方面的灵活性和已建立的能力，补料分批工艺在行业mAb生产中被普遍使用。一种用于高产量补料分批收获液的强化澄清工艺有望降低细胞生物量以及工艺相关杂质的水平，包括染色质复合体、宿主细胞蛋白(HCP)、宿主细胞DNA (HCD)、内毒素和病毒污染物。据报道，具有改善表面性能的功能化深层过滤器，如3M的Zeta plus系列和默克的Millistak系列，可在单个步骤中实现澄清和工艺杂质的清除。Castro等证实，一种具有水凝胶层的合成深层过滤器（以季胺修饰）可以澄清IgG1 CHO细胞收获液，同时降低工艺相关杂质水平。在HCP清除方面，改进的深层过滤器的性能比基于纤维素的传统深层过滤器好17倍。
尽管深层过滤器具有清除杂质的优点，但由于不同批次杂质的结合能力不一致，而且人们对杂质清除的机制了解不多，这对深层过滤器的使用造成了一定的限制。为了了解清除机制，Singh等使用表面修饰的合成深层过滤器 (Emphaze ST-AEX和Emphaze AEX)研究了深层过滤器离子结合能力与工艺杂质清除数据之间的相关性。研究表明了季胺深层过滤器(Emphaze ST-AEX)的高结合载量，当用于澄清Protein A步骤后工艺液流时，实验显示相比传统吸附深层过滤器（Zeta Plus 60SP05A），结合载量提高了700%，可以完全取代阴离子交换层析。在商业化mAb纯化工艺中，Emphaze ST-AEX过滤器可在高盐条件下达到6 log降低值 (LRV) 的HCP清除率，HCD降低到检测限以下。这种降低效率可通过在两步(而不是三步)纯化平台内获得所需的纯度，而达到更高的工艺效率和批次吞吐量，减少车间时间并提高工厂吞吐量。
近年来，有文章报道了在膜澄清前用絮凝剂和稀释剂进行预处理的高密度细胞培养液澄清策略。尽管预处理技术在澄清高密度细胞培养液方面取得了成功，但工业化的生物工艺仍采用不经预处理的、基于膜的澄清技术，因为它能最大限度地降低风险，包括絮凝剂成分相关毒性、监管顾虑、清除挑战，并避免引入工艺复杂性。
深层过滤也可调节产物异构体的水平，如聚体和二硫化异构体。Yu等比较了两种合成深层过滤器去除高分子量和低分子量IgG1物质(HMWS和LMWS)的性能。结果表明，相对于单体，聚体对深层过滤膜的亲和性更强，这可使聚体的含量从4.7降低到1.1%。在另一项研究中，更高的通量和压差导致了IgG1和4型 mAb中二硫键的减少，这是由于细胞裂解的增加导致了氧化还原酶的释放。这种现象在连续离心中也有观察到，可以通过确保澄清的收获液中足够的溶氧来克服。因此，在澄清步骤的早期工艺开发过程中，仔细优化不同的工艺参数是至关重要的。
灌流工艺的澄清
灌流工艺已显示出强化mAb生产的前景，其在连续模式下操作时，可达到高达25 g/L的产物滴度以及200 x 10^6 cells/mL的细胞密度。灌流反应器中细胞截留装置角色，是维持培养基和代谢物连续流入和流出灌流反应器，其大致分可分为基于膜和基于沉淀的技术。Somasundaram等最近强调，基于膜的技术，如交替式切向流过滤(ATF)和切向流过滤(TFF)，适用于与灌流生物反应器集成，并与连续Protein A层析相整合。
基于膜的细胞截留装置的主要缺点是污染和产物截留。Karst等研究表明，与ATF设备相比，TFF系统的产物回收率损失可达50%。ATF系统优化的回收率和污染特性归功于它的工作模式，即通过隔膜泵的反复运动，使细胞培养液来回流动通过中空纤维过滤器。这种交替运动被认为可以减少膜污染并提高产物透过，从而提高产物回收率，这在近年来使得ATF系统的行业采用显著增加。在TFF模式中，用低剪切离心泵代替蠕动泵也被证明可在一定程度上限制产物损失和膜污染。此外，也有必要了解和优化不同的工艺参数，如膜孔径、停留时间、进料流量和进料体积，这些参数会影响细胞截留装置的性能，包括产量、产品筛分、细胞剪切以及膜污染。膜组件的类型也会影响过滤性能。Wang等使用了一种切向流深层过滤器（TFDF），证明2-10𝜇m的孔径可使产物100%透过，其在特定应用中，可能可替代广泛使用的灌流收获澄清中空纤维膜组件。总的来说，为灌流生物反应器选择合适的膜澄清装置取决于多个标准，如工艺持续时间、运行成本、维护、期望的产物回收率、在高细胞密度下降低污染、可放大性以及细胞活性的维持。
原文：S.Nadar, G.Shooter, B.Somasundaram, et al., Intensified Downstream Processing of Monoclonal Antibodies Using Membrane Technology. Biotechnology Journal, 2021, DOI:10.1002/biot.202000309.
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