无细胞表达：一项具有真正颠覆性潜力的技术
本文节选自“Cell-Free Expression: A Technology with Truly Disruptive Potential”，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
生物工艺工程师Beatrice Melinek是伦敦大学学院未来靶向医疗制造(FTHM)中心的博士后研究员，她专注于使用无细胞蛋白合成(CFPS)作为分层生物治疗药物分布式生产的平台。此前，Melinek专注于病毒载体和疫苗的纯化工作，拥有生物化学工程的工程学博士学位和伦敦大学学院血液学部门的博士后经验，开发了一种新的、基于层析的分析方法，用于测量空和完整腺相关病毒(AAV)衣壳。她还参与了Univercells Technologies脊髓灰质炎疫苗生产工艺的优化工作。在那之前，她在Atkins Global工程设计公司的动态过程模拟团队工作了6年，之后又返回了学术界。
Melinek拥有两个硕士学位：一个是伦敦帝国理工学院的化学工程学位，另一个是伦敦大学学院的生物化学工程学位。去年，她是9月份发表在BPI上的一篇关于无细胞表达的报告的主要作者和通讯作者。今年春天，我再次找到了她，继续跟进了这个议题。
我们的对话
我们正在讨论这个议题中关于表达滴度和单位体积产量的内容。在这方面，CFPS与基于细胞的系统相比如何? 近期和长期的发展前景如何?
通常，CFPS的滴度比细胞系统的滴度低一个数量级。在特定条件下，CFPS的滴度可达到3 g/mL，而中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的滴度可达到10 g/mL。提高CFPS滴度可能是使该技术更具成本竞争力的关键。
在CFPS中，蛋白质生产速率比体内的速率慢200倍。但是你可以通过组合必要的试剂随时开始反应 - 所以，由于没有这种水平的控制，细胞培养的时间尺度实际上要长得多。
两种系统都有可能达到滴度的限制，但我们预计CFPS的优化空间将比基于细胞的系统更大。这个假设是基于：
增加对CFPS的兴趣和投资，将帮助我们进一步加深理解 基于CHO的生产的收益在降低 CFPS可获得的滴度在持续提高
此外，我们推测 (因为在CFPS中，不需要转移能量来保持细胞存活)，在CFPS中，理论上最终可达到的滴度可能比在基于细胞的系统中要高得多。
CFPS系统能进行复杂的糖基化和其它翻译后修饰吗?
这个过程是否比细胞培养生产复杂蛋白质更可控? 一些来源的细胞提取物(如CHO、昆虫、人类K562和植物细胞)可以根据其自身结构进行糖基化，并通过改进的制备过程来确保所需要的结构保持完整。Tinafar等人在2019年的一篇文章中很好地说明了目前可用的PTM（翻译后修饰）。
Hershewe等人声称，在CFPS中可能可实现对糖蛋白进行更严格的控制。这可能 – 对于抗体偶联药物(ADC) - 从长远来看，这将是CFPS的关键优势。它还可以通过更快的原型化来加速糖蛋白的研究。类似地，对于二硫键的产生，CFPS可能需要特定的提取来源或菌株以及二硫键形成酶。一种复杂性来自于平衡蛋白质生产和PTM条件的潜在需求。
迄今为止，使用CFPS成功地生产了哪些生物药蛋白质/肽? 有哪些公司在临床研究中使用了它吗?
Sutro Biopharma是这一领域的领导者，通过非天然氨基酸来提高ADC的质量控制。Sutro目前正在对一些候选药物进行1-1b期试验。
就在AltHost联盟等组织正在研究新的生物表达系统时，CFPS开发者正在试验新的细胞提取物来源。目前最有前途的生物治疗应用平台是什么?
正如你所说，我们正在考虑广泛的细胞提取物来源。每种类型都有其优缺点。考虑到成本，我们使用的是大肠杆菌。其他研究人员会对特定的PTM感兴趣，这可能会限制他们可以使用的来源材料。然而，酶的方法可以应用，或可能被开发。在概念上，我喜欢的一个想法是使用血液作为提取源，这可能是一个真正个性化的方法，尽管显然需要大量的工作来使其成为可行的操作。
COVID-19大流行使大家更加意识到，我们需要迅速开发针对传染病病原体的疫苗和药物。一些新兴技术，如mRNA，发展得比我们大多数人想象的要快得多。CFPS如何帮助解决未来的需求?
CFPS的若干应用与对抗大流行密切相关:
基于纸张的诊断技术如果得到完善，可以大大降低大规模快速检测的成本，在低收入和中等收入国家尤其适用。 嵌入在衣服上的诊断工具，比如可以显示佩戴者是否被感染的口罩 在进行CFPS或基于细胞的生产之前，可用于优化疫苗和治疗性结构设计的高通量、快速原型构建
CFPS有潜力用最少的设备使疫苗本地化生产成为可能，甚至不需要冷链（如果成分需要冷冻的话）。Stark等人提出了一种用于生产偶联疫苗的随需应变的医疗点系统。Adiga等人制作了一个手提箱式生产系统，用于在难以到达的位置和困难情况下进行治疗性蛋白生产。
与生物技术的其它领域一样，CFPS的一些研究小组已将重点转向大流行问题。在未来的几个月和几年里，我们很可能会发现这产生了多大的影响。随着时间的推移，一些更广泛的影响可能会产生回响：例如，认识到需要本地化生产和企业之间的技术转让来满足需求，在这方面，CFPS比传统方法更具潜在的优势。
以细胞提取物为原材料，CFPS将许多传统的生物生产问题转向“上游”，而不是消除它们。例如，CHO和HeLa提取物会带来哪些病毒安全问题? 如何确定和保证原材料的一致性?
我还没有深入考虑过病毒安全性的问题。据我所知，CFPS和基于细胞的系统有着同样的风险，这似乎是合乎逻辑的。可以对提取物进行除菌过滤(至少对大肠杆菌的提取物是这样)，一些冻干条件可以在灭活或杀死病毒的同时保持提取物的活性。这不是我的专长。此外，您可以设想设计一种分析方法来检测提取物的测试样本中的常见病毒污染物。基于CFPS的工艺的下游部分不太可能与基于细胞的工艺有很大的不同 - 包括一些在清除病毒中起作用的步骤。
确定原材料的一致性是一个大问题，尤其是对我们在FTHM中心交谈过的行业专家来说。我们目前正在研究这个问题。有一种观点认为(就像蛋白质疗法一样)，正确控制的过程应该会产生一致的结果 - 这也适用于提取物的生产。然而，证明提取物的一致性在很大程度上是一个悬而未决的问题。部分解决方案包括使用报告蛋白，检测核糖体活性，测量mRNA生产率，检查核酸酶活性。可能需要一整套分析来放行一批提取物。
你是否预见到一些目前用于生物生产的设备在未来会转变为生产细胞提取物?细胞提取物有可能商品化吗?
我相信如此。如果CFPS要用于随需应变的护理点生产，那么可能需要集中生产提取物。
CFPS反应工艺开发的主要关注点是什么?关于硬件质量确认或工艺验证方面有什么棘手的问题吗? 哪些类型的过程中监测技术可以使用 - 或者仍需要开发?
假设提取物验证问题可以解决，CFPS反应本身应该比基于细胞的反应更具可重复性，因为它本质上是一个“简单的”化学反应或催化反应。不同产品类型的关键工艺参数存在一些可变性，但采用质量源于设计(QbD)方法和使用高通量方法应该能够评估哪些参数对给定的产品/结构是重要的。这就清楚了哪些方面需要最小心地控制，并可能用于验证每次运行。某些在线/近线监测技术(例如拉曼或质谱)也可以帮助生产商监测前体、代谢物的浓度，在某些情况下，还可以监测产品的浓度。背景 (提取物) 的均一性会促进这一点。
此外，如果反应用于治疗药物或疫苗的大规模生产，那么目前使用的相同类型的质量控制(QC)分析可能可以用于CFPS源性产品。然而，如果我们想在分布式生产中使用CFPS，那么监管标准对QC的挑战可能会更加复杂。
原文：C.Scott, B.Melinek, Cell-Free Expression: A Technology with Truly Disruptive Potential. BioProcess Insider, 2021.
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