CHO细胞的灌流培养：生物学研究
本文节选自“Perfusion culture of Chinese Hamster Ovary cells for bioprocessing applications”，由于水平有限，详细内容，请参考原文或往期推送“针对生物工艺应用的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞的灌流培养”、“CHO细胞的灌流培养：系统配置”和“CHO细胞的灌流培养：参数优化”。
生物学
细胞生物学是确定生物工艺的“终极”因素。然而，我们对哺乳动物细胞的生物学性质的了解仍然有限。鉴于基因编辑的发展，在灌流特异性环境下，使用合理工程化的细胞系的可能性特别令人感兴趣。
细胞系
现代生产和研究中使用的CHO祖细胞系是1958年发展起来的。从那时起，许多策略被用来诱导有利的“突变”，包括适应悬浮培养、无血清生长和筛选方法，如谷氨酰胺合成酶(GS-)或二氢叶酸还原酶(dhfr-)敲除。这导致了许多表型不同的现代细胞株。
这里，根据细胞系是否来自CHO-K1、CHO-DG44或CHO-DUKX进行分类，这是三种最流行的谱系。CHO-K1是商业化生产中最常用的细胞系，也是第一个将其基因组公开的。然后，使用CHO-K1衍生出了CHO-DUKX。CHO-DUKX和CHO-DG44都是dhfr-。在写明细胞系的52%的论文中，我们发现37%的论文至少包含一种CHO-K1源性细胞系(不包括CHO-DUKX)。如果另有说明，24%的论文使用源自CHO-DUKX的细胞系，25%使用CHO-DG44，13%使用其它或未识别的细胞系。然而，论文中最大的一部分(48%)忽略了所使用的特定细胞系的身份说明。在这些情况下，与行业相关的论文比那些与纯学术相关的论文更有可能省略细节，这可能是出于专利方面的考虑。
尽管细胞系和细胞系之间存在差异，但文献中很少对不同细胞系或克隆进行比较。虽然一些研究确实比较了不同的细胞系，但这些差异经常被其它变量所混淆。然而，一项研究表明，对生物质或产物生产的倾向性被认为是一种遗传性状，即使在不同的培养模式下也是如此。此外，产物质量属性可以因为生产细胞系的遗传背景而变化。其它研究表明，培养基需求和剪切敏感性也是细胞特异性的属性，其对生物工艺有直接影响。因此，可以得出结论，在细胞系开发过程的初始阶段，亲代细胞系的选择至关重要，但这一点很少有报道。这可能代表了未来研究的一个极有前景的领域，并且，针对灌流而优化的克隆选择可能受益于与补料分批不同的方法。
产品类型
最初吸引各家公司使用灌流系统的优势之一是产品在反应器内的滞留时间短，允许生产在补料分批系统中会降解的产品。因此，许多人凝血因子类产品成为21世纪初灌流的首选产品。然而，随着灌流培养的成熟和经济竞争力的提高，抗体开始主导研究领域(图4)。这一趋势得到了单克隆抗体市场销售增长的支持，其自2000年以来增长了100多倍，目前市值接近2000亿美元。
图4. 文献报道的、使用CHO细胞灌流培养工艺生产的产品比例。
优化的灌流技术的另一个结果是概念验证文章的逐步减少，比如生物反应器设计，并转向具体细节，如产品滴度和质量。因此，在2000年至2010年间，只有27%的论文评估了产品质量，但在2015年之后发表的论文中，这一数字翻了一番，达到54%。与早期的文献相比，许多较新的文献的内容也非常详细，得益于在理解产品质量属性方面的发展，且此类文章反复强调了灌流培养在生产高质量产品方面的能力。
生物工程策略
由于很多研究主要集中在反应器设置和操作上，而不是细胞系工程上，因此大部分研究都是针对CHO细胞灌流培养进行的。然而，随着CRISPR等新的生物技术工具的出现，细胞系统本身的优化已成为行业关注的焦点。为了评估这一点，我们根据他们的研究领域对相关文献进行分类，“生物学因素”表示作者目的性地修改或监测细胞生物学，作为一个过程变量。我们发现，仅2017年以来，就有超过70%专注于“生物学因素”的研究发表，这突显出人们的兴趣在不断增加。
在这里，理解细胞的生物组成最有力的工具是“组学”数据。在CHO细胞灌流培养中，“组学”被用来理解假稳态行为和高细胞密度的影响。虽然某些特征，比如对生物质积累的偏好，在半连续灌流、批次和补料分批培养中都是可以转移的，但其它研究表明工艺模式之间存在差异。因此，在摇瓶或其它生物反应器模式中产生的大量组学数据可能不能直接应用于灌流培养，这就突显了灌流特异性“组学研究”的重要性。
对大规模组学数据包的解读具有不小的挑战性，但通过新的工具，如CHO基因组规模模型，其可获得性正在变得愈加容易。该模型具有整体工程策略的潜力，被认为是细胞系工程进化的下一步，并且研究已经利用了新的可用计算机工具。该模型也被用于灌流建模以及预测细胞行为，并对先前发表的数据进行动态建模。此外，也出现了其它预测模型，其主要关注的是关键质量属性。
一旦理解了组学数据包，并确定了代谢工程策略的潜在目标，CRISPR/Cas9系统已被证明是CHO细胞工程的一个强大工具。迄今为止，研究重点集中在糖基化模式的修饰和抑制性副产物的降低，同时抑制凋亡方面的研究也很有前景。组合起来，“组学”和基因工程工具为合理设计的CHO细胞的未来带来了巨大的希望。
未来展望
行业对灌流工艺的兴趣的复苏是显著的。在过去的5年里，关于这个主题的文献增加了一倍多。一次性使用技术的进步和生物制药行业的持续增长，使得最佳反应器设置 (即结合切向流截留设备的STR)趋于一致，使得该领域的研究具有更大的可转化性和可实现性。文献和硬件趋势的转变也与对这些系统的潜在生物学的日益关注相一致，包括更好地理解和改进这一领域的工具。随着工业4.0被设定为未来趋向连续设置的生产工艺的指导，研究预计将进一步加快。
此外，随着生物制药市场持续增长，焦点转向更复杂的分子和基于抗体的疗法，持续的竞争现在很可能推动新的、针对灌流的研究。当考虑到新技术背景下的生物工艺的历史时，最具研究潜力的领域在于细胞系开发、培养基优化以及工艺集成。
在细胞系开发方面，合理设计细胞系和产品的能力处于研究的前沿。灌流具有一定的假稳态运行的优点，可以通过组学工具更容易建模和优化。克隆筛选和工艺性能的早期指标也有重大影响，因为大多数现有的工艺要么是批次导向的，要么在平衡转染效率与克隆存活和生长之间挣扎。在此，应用筛选过程可能有助于鉴别出在灌流中优于传统培养皿中扩增的细胞系。
减少灌流相关培养基的体积和成本也是至关重要的。虽然开发新培养基配方是一项艰巨的任务，但最近的成功案例将鼓励行业继续深入开展相关的工作。这些方法包括使用浓缩补液改变补液策略，结合现有培养基，以及采用蛋白质组学，每一种方法都对生产率和产品质量产生了巨大影响，培养基和补液策略的精细设计也对下游工艺有影响，理想的方法是减少体积或调整收获和纯化的方法。
最后，灌流工艺对工厂运营和设计的影响代表了一种工艺强化和连续生产的方法。这两个特点都是工业4.0所青睐的。虽然生物制药行业在吸收工业4.0原则方面略有滞后，但软传感器、预测性控制和生物工艺建模工具的开发已准备好填补差距。这些工具不仅有助于实现端到端的连续工艺，而且将进一步加强灌流生产作为一个有价值的平台的地位。
原文：M. A. MacDonald, M. Nöbel, D. R. Recinos, et al., Perfusion culture of Chinese Hamster Ovary cells for bioprocessing applications. Critical Reviews in Biotechnology, 2021, https://doi.org/10.1080/07388551.2021.1998821.
相关阅读：