RNA治疗药物的纳米级递送平台：递送材料的设计
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鉴于前文所述的障碍，需要可安全且有效地递送RNA 的方法。在本节中，我们将讨论两大类RNA 递送材料（聚合物和脂质纳米颗粒），其中许多如图 2所示，同时介绍对其设计很重要的考虑因素。
图 2. RNA 递送材料。已成功用于体内递送 RNA 治疗药物的可电离脂质和聚合物的例子。值得注意的是，SM-102 和 ALC-0315 目前分别用于mRNA-1273 和 BNT162b2 的临床应用。
聚合物纳米颗粒
相比聚合物NP，LNP 已迅速成为RNA 的首选纳米载体，其在进行中的临床试验中的相对数量就证明了这一点。然而，关于可生物降解聚合物系统用于 RNA 递送的实用性的临床前数据正在不断增长且显示出其重要性。尽管 LNP 可能比聚合物载体具有生产优势，但由于大多数聚合物系统的多分散性，我们预计在LNP 和聚合物递送系统中将出现对属于这两个类别的新递送系统的临床研究。基因治疗的早期努力旨在使用合成聚阳离子（例如聚乙烯亚胺 (PEI)和聚-L-赖氨酸 (PLL)）将质粒DNA 递送至细胞。尽管对于基因治疗应用，PEI 继续被用作商业上可用的试剂，但它在很大程度上已被其它类别的聚合物所取代，这主要是因为它的毒性。PEI的毒性部分归因于它缺乏可降解的连接，研究表明，在低分子量PEI链之间引入可生物降解的键，可以显著降低其体外细胞毒性，这促使行业积极寻求可生物降解的替代物。2003年，有研究证实了第一个半自动合成和筛选大型聚(b-氨基酯) (PBAE) 组合文库，用于在体外研究中将 DNA 递送至细胞，其性能优于 PEI。从那时起，已经研究了许多使用PBAE 和聚合性化学物的聚合物组合库。
从这些聚合物库筛选工作中，已经发现了影响聚合物NP 功效的几个重要因素。首先，发现聚合物在酸性pH 下的缓冲能力是其作为递送载体的功效的重要影响因素。研究已发现某些模体，例如咪唑和胍基团，在促进络合和内体逃逸方面特别有效。还发现含有双酚 A(BPA) 的基团在掺入 PBAE 时是有效的；有趣的是，当将 BPA 衍生化合物作为赋形剂添加到其它NP 时，也可以提高功效。在聚合物结构中引入疏水基团也可以改善NP 的自组装和稳定性。例如，虽然单独的低分子量PEI 无法有效递送 siRNA，但通过在 600-Da PEI 的结构中添加C15 尾而合成的 7C1 被发现可促进 siRNA 在体内递送至肺内皮细胞，ED50低至 0.02 mg/kg。
除了可电离或阳离子聚合物的结构之外，含有RNA 有效载荷的制剂在其稳定性和功效方面也起着重要作用。例如，与电荷比相关的纳米颗粒中的氮磷比在许多研究中被发现是核酸递送效率和细胞毒性的重要因素。将PEG-脂质掺入聚合物纳米颗粒中可以防止在延长时间内的聚集并提高mRNA 转染效率；然而，正如预期的那样，这种效果取决于聚合物结构是否可以与PEG脂质的疏水基团复合。结合其它脂质，如二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE) 和可电离或阳离子脂质，形成杂化聚合物-脂质纳米颗粒，也已被证明是改善体外和体内 RNA 递送的有前景的方法。
脂质纳米颗粒
相比聚合物NP，LNP 已迅速成为RNA的首选纳米载体，正如它们在正在进行的临床试验中的相对数量所证明的那样，部分原因是与某些聚合物材料相关的更高毒性，以及其它一些问题，例如更高的批次间的差异性。早期形式的RNA LNP 由与阳离子脂质以及天然存在的磷脂混合物复合的mRNA 组成。尽管能够在体外和体内转染细胞，但研究发现一些阳离子脂质具有相关毒性，促使人们寻找毒性较小、可电离的同类物质。目前这一代LNP 通常由四种主要成分组成：磷脂、甾醇、PEG-脂质，以及可在内体pH下质子化的可电离脂质。由于可用于可电离脂质结构的化学空间及其在摄取和内体逃逸中的重要性，LNP开发的大部分重点都放在了可电离脂质的发现和开发上，例如大量用于开发新型可电离脂质的组合库筛选的数量。虽然寻找新的磷脂、甾醇和PEG-脂质成分（通常被称为“辅助脂质”）受到的关注较少，但其优化也可以显著改善体内纳米颗粒的功效。例如，已发现用DOPE 取代二硬脂酰磷脂酰胆碱 (DSPC) 可改善使用 C12-200 LNP 的小鼠肝细胞的转染和选择性，而掺入18:1Lyso PC 已被证明可提高 7C1 NP 在小鼠各种器官的内皮细胞中的效力。同样，PEG-脂质的选择可以极大地改变 C12-200 LNP 的体内生物分布。此外，研究发现，在传统的四组分LNP 设计中加入额外的赋形剂可以对疗效和体内分布产生显著影响。
与聚合物纳米颗粒一样，脂质纳米粒子的设计也出现了许多启发式方法。多项研究发现，纳米颗粒pKa 在 6-7 范围内是静脉内和肌肉内给药 LNP 的理想选择。然而，应该注意的是，正如所有提到的启发式方法一样，这种效果高度依赖于脂质结构和配方。一项对10 种可电离脂质的研究发现，尽管 pKa 低于 7 的LNP 确实倾向于实现更高水平的性能，但最佳范围内的pKa 并不能保证性能；另一个发现，与 LNP pKa 相比，在晚期内体 pH 为 5时，功效与 LNP 表面电离水平的相关性要强得多。将支链和不饱和尾部掺入 LNP 的可电离脂质或磷脂成分中也可以改善体内肝细胞的转染，最有可能是通过促进反六角相形成使内体膜在酸性pH 下不稳定。最后，在可电离脂质结构中加入可降解的键，特别是在脂质尾部，可以降低毒性。由于清除不良，以高剂量重复给药可电离脂质而没有可生物降解的尾巴也会导致组织中随着时间的推移而积累，而将酯添加到烷基链中可以显著改善降解并防止积累。
纳米颗粒递送的加速方法
虽然对 RNA 递送 NP 的结构-功能关系的理解越来越多，但化学结构的微小变化可能会导致意想不到的活性变化。例如，可电离脂质尾部饱和度的微小变化可导致体内mRNA 递送至肝细胞的效力发生数量级的变化。类似地，聚合物侧链和可电离脂质尾部中亚甲基的数量可导致功能性mRNA 分别在体内向鼠和猪肺以及体外向原代人 T细胞的递送发生显著变化。除了可电离脂质或聚合物的结构外，制剂环境也可以对纳米颗粒的效力产生显著影响。因此，尽管启发式方法可以指导实验设计，但很明显，NP的体内评估对于识别和优化新型递送材料是必要的。
体外筛选 NP 的有利特性是一个有吸引力的概念，因为这些分析相对便宜，并且通常可以在 96 孔形式中以高通量方式进行。例如，2015 年的一项研究使用高通量转染和成像方法筛选了 45,000 多种小分子化合物，以研究增强体外 siRNA LNP 摄取的能力，突出了以大规模并行方式筛选 NP 功效的能力。高通量动态光散射 (DLS) 和基于板的 TNS 分析还允许快速测量NP 粒径和 pKa。然而，尽管这些分析的结果可能会为某些应用提供对 NP 行为的洞察力，但它们对体内功效的可翻译性传统上相对较差。体外培养细胞模型中的NP 功效充其量与体内向细胞的递送只有微弱的相关性。此外，多项研究表明，对于直径<200 nm 的 LNP，纳米颗粒粒径、多分散性和包封效率与体内功效没有很好的相关性。
作为体外预筛选的替代方案，已开发出快速方法来加速体内NP 性能评估。2017 年，开发了一种对具有独特 DNA 序列的LNP 进行条形码编码的方法，通过分离组织和测序来识别成功递送的DNA 条形码，同时跟踪单个动物中多个 LNP 的生物分布；类似的方法也已用于对含有 mRNA 的 LNP 进行条形码编码。这种方法已被用于直接探测NP 的体内行为，其所能达到的通量之前是不可能实现的，这产生了大量关于NP 如何在体内被运输的数据。值得注意的是，NP分布到某个组织并不一定会导致其在那里表达。为了解决这个问题，Sago等人开发了一种混合方法，将 Cre mRNA-Ai14报告系统与 DNA 条形码相结合，以追踪功能递送而不是生物分布。简而言之，DNA条形码与 Cre mRNA 共同制剂并给予 Ai14 小鼠，其中包含依赖于Cre 的 tdTomato 表达盒；然后通过 FACS 对tdTomato 阳性细胞进行分选，并将与 tdTomato 信号共定位的 DNA 条形码量化为功能递送的间接测量。使用这种方法，Sago等人评估了数百个在体内递送至内皮细胞的LNP，其中的热门是用于 CRISPR/Cas9 介导的脾内皮细胞和肝细胞基因编辑。研究还开发了类似的方法来筛选体内功能性 siRNA 递送。尽管这些方法有一些重要的限制，例如模型依赖性和功能递送的固有间接测量，但它们与其它NP 条形码方法一起结合的数据集将加速RNA 递送 NP 的发展。
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原文：L.H.Rhym,D.G.Anderson, Nanoscale delivery platforms for RNA therapeutics: Challenges andthe current state of the art. Med, 2022, 3(3): 167-187.
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