用于疫苗开发的高产量酵母及杆状病毒-昆虫细胞平台
本文节选自《Emerging Technologies for Low-Cost, Rapid Vaccine Manufacutrue》，更多详细内容，请参考原文或往期公众号文章《用于低成本、快速疫苗生产的新兴技术》。
用于重组疫苗生产的高产量酵母平台
传统酵母平台的主要挑战包括：1）相比人源细胞，不同的糖基化模式；2）特异性产量较低；以及3）对于多种疫苗，重组蛋白抗原需要组装形成VLP，以提高免疫的效力。为解决这些挑战，通过过表达伴侣蛋白，研究人员正在开发基于高产量人源化酵母的表达平台。为将酵母的高甘露糖特性改变为人型的复杂糖基化模式，对酿酒酵母、毕赤酵母中的糖基化通路进行基因修饰。目前，经糖工程处理的酵母可表达、分泌大多数重组蛋白，但滴度一般低于1 g/L，某些可达到4-5 g/L。需要增强可提升酵母产量的基因工程处理，以达到报导的非糖工程处理的毕赤酵母的产量，据报导，后者在甲醇诱导和无甲醇工艺中，产量分别可达到35 g/L和20 g/L。为避免重组抗原蛋白自组装形成VLP的需求，可以将单体异源抗原连接到高免疫源性的蛋白质结构域或使用合适的佐剂，以增加免疫源性。
上游和中游工艺
下图所示为基于人源化、高产量酵母的疫苗生产的工艺流程，用于在酿酒酵母中进行HBsAg抗原生产。人源化酵母可以细胞建库，并与传统酵母一样进行扩增。
在人源化、高产量酵母中进行的重组蛋白质疫苗生产。已经有报道实现了在酵母中的人样复杂糖基化，但是，该目的和高产量分泌还没有在生产规模条件下执行过。
对于基于人源化酵母的重组抗原生产，可使用标准的酵母生物工艺。质粒上的抗原基因启动子通常来源于结构性糖酵解基因，因此，抗原表达与葡糖糖消耗及生物质增长成正比。为降低附加体质粒的损失和随之而来的产量下降，需在生产过程中监测质粒保留情况，并施加选择性压力。最终的发酵培养收获液需要检测微生物纯度。基于酵母的生产系统天然不能承受人或动物病毒的污染，所以，在这方面不需要进行专门的检测。整个培养周期，从冻融到批次发酵结束，一般需要1周时间。
分离、细胞裂解和纯化
使用人源化酵母生产的蛋白质的下游工艺与传统酵母发酵的蛋白质分离和纯化操作相似。相比基于动物细胞的生产，基于酵母的生产的下游分离操作可显著简化，且更经济，因为：1）酵母潜在的高重组蛋白表达和分泌产量，以及2）分泌的天然宿主细胞酵母蛋白的量比较低。但是，在糖工程处理酵母中，表达和分泌产量仍需要提高，以达到非糖工程处理毕赤酵母高达35 g/L的水平。
用于重组疫苗生产的昆虫细胞-杆状病毒平台
杆状病毒是一类较大的双链DNA昆虫病毒，可容纳多个外源基因，通常用于在昆虫细胞系进行重组蛋白的生产。目前已有商品化的分子克隆方法，可在1天内快速生成杆状病毒载体，包括CRISPR-Cas9技术。然而，通过噬斑纯化选择含有目的基因的重组杆状病毒通常需要1周左右的时间。为优化噬斑选择和纯化，重组杆状病毒通常是利用大肠杆菌细胞中细菌人工染色体（BAC）和Tn7转位形式的前体杆状病毒基因组生成。
昆虫细胞培养在生产重组蛋白方面具有以下优势：1）用于大体积培养时，具有比动物细胞系具有更高的稳健性；2）高效的杆状病毒载体构建技术；3）S2稳定修饰的昆虫细胞可以在灌流培养中连续生长；4）用于重组蛋白和疫苗的生产已被证明具有工业规模适用性；5）杆状病毒不会对人类健康构成威胁。
昆虫细胞的生长速度高于动物细胞，但低于酵母或细菌。昆虫细胞培养在生产重组蛋白方面存在以下限制：i）不能合成哺乳动物特有的复杂糖型结构，不过，最近通过具有模拟人类糖基化功能的杆状病毒系统，这种情况得到了改善；ii）疫苗生产成本较高，与基于动物细胞培养的疫苗生产成本相当。
为将昆虫细胞 - 杆状病毒表达系统应用于多种疫苗的生产，可以使用Multi-Bac和ADDomer多蛋白表达平台。MultiBac为生成重组杆状病毒DNA、以在昆虫细胞培养中表达VLP多蛋白复合物提供了一种简单而通用的方法。ADDomer是一种合成的多蛋白支架，源于人腺病毒3型血清型的VLP，使用MultiBac时可获得高产量。ADDomer由 ~60 kD的蛋白质亚单位（原体）组成，其组装形成~300 kDa的五聚蛋白质复合物（五聚体）。12个五聚体形成ADDomer，总分子质~3.6 MD。ADDomer蛋白支架可在其表面呈现多达360个基因编码的抗原决定因子（表位），包括纯化标签（如生物素、几丁质结合蛋白、Myc标签，以及用于规模化生产的组氨酸标签），以便于下游纯化。ADDomer被选择作为下一代疫苗平台，以代表昆虫细胞 - 杆状病毒表达系统，因为：1）它具有高度的可定制性，可在其表面显示多种抗原肽段、蛋白质和长度达200个氨基酸的蛋白质结构域；2）使用MultiBac系统可快速重新配置；3）由腺病毒戊基蛋白的拷贝组成，其自发形成高度稳定的VLP；4）大小与病毒相似，可增强其免疫原性；5）可含有佐剂样表位；6）非复制性，不携带遗传物质；7）易于工业化生产；8）具有热稳定性，不受冷链影响，这在低、中收入国家具有优势。
这里，介绍在昆虫细胞中生产多蛋白复合物的工艺，如ADDomer。ADDomer生产工艺的规模放大基于流感病毒血凝素（HA）的生产，其用于Flublok疫苗的生产，因为HA多聚体的大小与ADDomer相似。
上游和中游工艺
ADDomer在来自MultiBac表达载体的Hi5或Sf21昆虫细胞中表达，操作时，扩增细胞和杆状病毒。
昆虫细胞在小型和中型规模生物反应器中扩增后，细胞被转移到生产生物反应器中。如下图中的灰色箭头所示，在感染之前，生产生物反应器中过量的细胞可以返回到上游工艺中。昆虫细胞分裂并达到约0.5 – 0.9 x10^6 cells/ml的密度后，以MOI 0.1 – 1加入杆状病毒，这样，细胞群落可在感染后至少倍增一次。加入的病毒感染昆虫细胞，ADDomer表达并留在细胞内。通过使用表达标记(如黄色荧光蛋白)或监测细胞密度，可按每12或24小时监测病毒表达情况。当表达趋于稳定或细胞密度停止增加后24小时，收获细胞。
使用MultiBac昆虫细胞-杆状病毒表达系统进行的重组ADDomer多抗原疫苗的生物生产。这里，工艺进行了规模放大，以进行用于流感疫苗生产的重组HA蛋白质表达。灰色箭头表示在病毒感染前，2500L生产生物反应器过量昆虫细胞反馈至上游工艺。
分离和纯化
感染的细胞离心收获。使用非离子表面活性剂(如脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、聚山梨醇和Triton X-100)从细胞中提取ADDomer，然后使用深层过滤澄清。在深层过滤中，细胞碎片和其它污染物被深层过滤器截留，含有ADDomer的澄清溶液通过过滤器。
深层过滤步骤获得的澄清溶液通过离子交换层析柱。使用pH值低于ADDomer等电点(pI)的缓冲液，可以将ADDomer蛋白结合在阳离子交换柱上，然后使用pH值高于该pI值的缓冲液洗脱。之后，根据分子克隆过程中添加的ADDomer标签与层析柱之间的特定相互作用，可以利用亲和层析对ADDomer进行进一步的纯化。两步柱层析之后，进行膜过滤，使用Q膜去除残留DNA。最后，使用超滤将ADDomer溶液的缓冲液组成置换成最终状态。
原文：Z.Kis, R.Shattock, N.Shah, et al., Emerging Technologies for Low-Cost, Rapid Vaccine Manufacture. Biotechnology Journal, 2019, DOI: 10.1002/biot.201800376.
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