高细胞密度培养和病毒疫苗生产的灌流控制
在2020年出版的《Animal Cell Biotechnology: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology》 一书中包括了题为“Perfusion Control for High Cell Denisty Cultivation and Viral Vaccine Production”的章节。该节内容讨论了旨在获得极高细胞密度的灌流工艺的设计和优化以及用于实现最佳灌流速率控制的策略的选择，其目的是在用于病毒疫苗生产的灌流工艺中保证高细胞特异性病毒产量，使病毒浓度达到10^10病毒子/mL。作者介绍了包括基于细胞浓度和代谢物或副产物浓度的反应器体积置换策略以及灌流速率控制，同时，讨论了在假灌流和小规模灌流生物反应器系统中，通过灌流速率控制达到高细胞密度的策略及其实际实验操作，包括使用悬浮细胞系MDCK、BHK-21、EB66以及AGE1.CR.pLX，分别用于流感、黄热、寨卡以及改良的安卡拉牛痘病毒的生产。本文为原文内容简介，详细内容，请参考原文。
简介
为防止感染性疾病的传播，人和动物的免疫接种仍是最有效的方案。接种的病毒性疫苗含抗原性结构（如活性衰减的病毒、灭活病毒或其亚单位病毒成分），刺激获得性免疫系统，诱导针对特定病原体的有效免疫反应。这使得疫苗的开发和供应对全球疾病控制和根除来说至关重要。然后，不断成长的疫苗市场、反复出现的流行性疾病以及新兴的疾病对当前的疫苗开发工艺造成了极大的挑战，故而需要建立新的工艺强化策略。
基于细胞培养的病毒生产的典型工艺包括两个阶段，首先是在反应器中增殖细胞，然后进行病毒感染。病毒进入宿主细胞，利用细胞机制，复制形成高病毒滴度。病毒复制和释放通常会导致细胞裂解，所以，病毒物料可在其峰浓度时批量收获。为强化悬浮细胞的病毒生产工艺，可对这两个阶段进行优化：感染前，宿主细胞可培养至更高的细胞浓度，并可调节感染时间点的工艺参数，以提高病毒复制。
针对细胞生长期的灌流速率控制策略
为获得高细胞密度，需要使用新鲜的培养基置换灌流生物反应器系统内的耗竭培养基，并通过膜等技术，将悬浮细胞截留在反应器内。在过去几年内，已经建立了多种不同的灌流速率控制策略，可为细胞连续提供足够的营养底物，并去除废弃物。
摇瓶和生物反应器中进行的灌流控制策略及其各自对底物浓度（红色）、反应器体积置换速率（蓝色）以及细胞特异性灌流速率（CSPR，绿色）的影响。a）假灌流培养，使用批量式培养基置换来控制灌流速率，可能导致暂时的补液过量和CSPR峰值。培养基置换时间点通常以时间间隔或代谢物水平来确定。b）与摇瓶不同的是，灌流生物反应器可使用基于VVD的制度实现恒定的培养基供给。灌流速率在固定的时间点步进式增加，以满足营养物需求。但是这种方式会在达到最高细胞浓度前，由于培养基的限制，而出现代谢物浓度和CSPR的波动。3）基于CSPR的控制策略从接种后开始，并维持CSPR恒定。VVD根据细胞的生长而增加。使用在线电容探针可实现工艺的自动化。由于在低代谢物水平下，代谢物摄取速率会降低，所以在培养中，代谢物浓度可能发生变化，如培养时间的后期。d）基于底物的灌流控制策略在达到特定的设定点之后开始，并维持代谢物水平。VVD不需要根据细胞浓度调节，且由于代谢物摄取速率变化，CSPR可能改变。使用在线检测设备可实现自动化封闭回路工艺控制。
假灌流控制策略 请参考原文
灌流生物反应器控制策略
灌流生物反应器组装示意图。天平1置于生物反应器下，以维持恒定的工作体积；无细胞的滤出液流速手动控制或基于在线监测调节。天平2用于确认滤出液流速。
反应器体积置换制度
每日反应器体积置换率（VVD）以总工作体积描述灌流速率。灌流速率通常设置为固定流速或者随培养时间步进式增加，即按预定的日程安排，在固定的时间点，切换为特定的灌流速率，这种方式不与实际细胞浓度关联，VVD通常基于先前实验的细胞生长和代谢速率进行选择。由于预先确定的灌流速率通常不计入生物系统的实际状态，这个制度通常不够稳定，以覆盖生物学差异（如细胞生长、代谢速率），即灌流速率没有针对细胞生长进行优化，通常会导致底物补充不足或过量。此外，代谢副产物可能积聚，形成抑制性浓度，影响细胞生长、产率和产物质量。所以，代谢物浓度和CSPR（pL/cell/day）可能在培养运行中发生变化，且由于生理变化（如特异性细胞生长速率）和工艺改变（如时间、工作体积），可能发生批次间的差异。如果这些改变较轻，特别是在已良好表征的稳定生产系统中，这种方法固定置换速率制度会是一个成功的策略，这种方式应用起来较为简单，不需要做太多的技术工作，在特定的底物供应情况下，细胞通常可生长至特定的细胞浓度，维持稳态条件。结合细胞废弃，这种策略有利于重组蛋白的连续表达。
细胞特异性灌流速率控制
灌流速率也可以根据活细胞密度（VCD）的检测来确定，从而为细胞提供恒定的CSPR和代谢环境。通过手动细胞计数或使用自动化细胞计数器，可根据生长性能，手动调节灌流速率。为优化取样点之间的CSPR控制，可使用生长速率来预测灌流速率，直到下一个取样点。灌流泵速可编程，以使灌流速率与预期的细胞生长相关联。通过使用在线生物质探针，检测生物反应器内的细胞体积或细胞浓度，并将信号反馈给灌流泵，也可以实现自动化。这种开放回路控制系统可根据实际的生长性能，实现灌流工艺的自动化以及高精度的运行，当然，这有赖于在线生物质检测的可靠性。不管怎样，基于CSPR的控制策略可在不同的细胞浓度条件下确保提供足够的培养基，从而，可研究细胞行为和产率。
生物反应器手动CSPR控制，用于AGE1.CR.plX培养。在感染阶段，提高的培养基置换与体积增加关联，以提高MAV滴度。a）细胞浓度（蓝色）、病毒滴度（红色）以及相对工作体积（绿色）。b）基于起始反应器体积的灌流速率（蓝色）和CSPR（绿色）。
基于CSPR的自动化细胞浓度控制，培养EB66细胞，生长寨卡病毒。a）在线电容信号（蓝色）、离线检测的活细胞浓度（蓝色）以及病毒滴度（红色）。b）灌流速率（蓝色）随细胞浓度增加，CSPR（绿色）保持恒定为34 pL/cell/day。
基于代谢的灌流速率控制
关键底物的变化，如葡萄糖或谷氨酰胺，是整体底物消耗的良好指示。离线代谢物检测通常用于常规的生物反应器取样，进而调节灌流速率，以维持稳态底物浓度。为进行更好的手动灌流速率控制，可考虑最近一个取样点的特异性细胞生长速率和底物摄取速率，以预测所需的灌流速率，直到下一个取样点。使用在线代谢检测设备可建立封闭式控制系统，输出信号用于控制灌流泵。基于底物的灌流速率控制需要对细胞营养需求有良好的了解，并确定关键代谢物，以避免过量或过低补液。
使用基于代谢物浓度的控制策略，培养EB66细胞，用于黄热病毒生产。a)细胞浓度（蓝色）和病毒滴度（红色），b）调节灌流速率（蓝色）以维持葡萄糖水平（绿色）和谷氨酰胺为1mM（绿色）。
除了底物外，副产物水平的检测也可以用于灌流控制。典型的副产物是乳酸，其形成通常与过量的葡萄糖摄取有关。乳酸会降低培养基的pH值，改变产物的糖基化结构，并潜在性地抑制细胞生长。一般需要低乳酸水平，其浓度可根据在线pH检测评估。培养开始时，培养基中的乳酸增加，pH值降低，随葡萄糖水平的进一步降低，许多细胞开始消耗乳酸，pH值会增加。仔细选择一个pH设定点，开始以新鲜培养基进行灌流，为细胞提供葡萄糖，从而维持最佳的生长条件。如果细胞不消耗细胞外的乳酸，新鲜培养基会稀释持续形成的乳酸，恒定的pH水平与恒定的乳酸浓度对应。这种策略非常有挑战性，需假定代谢物消耗速率与乳酸形成之间有良好的相关性，以避免控制器失败。此外，还需要考虑整体的培养基消耗。总体来说，这种控制策略可简单地用于带pH控制的先进生物反应器系统。
使用基于乳酸的灌流速率控制策略，培养AGE1.CR.plX至高细胞浓度。用于流感A病毒生产时，该策略根据恒定VVD趋势，更改为混合策略。a）细胞浓度（蓝色）、病毒滴度（红色）以及生物反应器的相对工作体积（起始600mL，绿色），b）-72 - -6hpi（橙色区域）以不同pH设定点（绿线）控制的的灌流速率（蓝线）。
病毒生产期的灌流速率控制策略
疫苗生产的第二个阶段，在达到所需的细胞浓度后，加入接种病毒，启动病毒复制。提高病毒产量有多种策略可选。从灌流控制策略看，细胞可先浓缩，降低灌流速率或暂停，以促进病毒吸附至细胞。在起始的病毒生产阶段，可调节灌流速率，以避免病毒被漂洗掉，并利于病毒复制。但是，控制策略的选择也可根据病毒-宿主细胞相互作用的特定特点，如细胞性代谢需求、摄取速率或副产物形成速率可能会在感染后发生改变。所以，可能需要使用混合灌流策略，即感染前的最后一个灌流速率，切换至恒定的VVD值。不管怎样，需要对感染阶段进行更深入的研究，以针对每种病毒-宿主细胞系统进行优化。
细胞特异性病毒产量（CSVY，以病毒子/细胞为单位）可作为生产系统考量的标准，其需维持或增加，以优化灌流系统的产率。CSVY定义为单个细胞生产的病毒量，表示为：CSVY=（Nvir.max – Nvir.init）/ Ncell.max，其中为Nvir.max病毒颗粒（病毒子）的最大值，Nvir.init为用于感染的病毒颗粒数，Ncell.max为细胞的最大值。
详细实验操作步骤介绍，请参考原文。
原文：
A.Nikolay, T.Bissinger, G.Granicher, Perfusion Control for High Cell Denisty Cultivation and Viral Vaccine Production. Animal Cell Biotechnology: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, 2020, 2095, https://doi.org/10.1007/978-1-0716-0191-4_9.
相关文献：
A.Nikolay, L.R.Castilho, U.Reichl, et al., Propagation of Brazilian Zika virus strains in static and suspension cultures using Vero and BHK cells. Vaccine, 2018, 36:3140-3145. （BHK-21细胞ATF灌流培养，生产寨卡病毒）
G.Granicher, J.Coronel, A.Pralow, et al., Efficient influenza A virus production in high cell density using the novel porcine suspension cell line PBG.PK2.1. Vaccine, 2019, https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2019.04.030.（基于高细胞密度培养的高效流感病毒生产）
S.Gutierrez-Granados, F.Godia, L.Cervera, Continuous manufacturing of viral particles. Current Opinion In Chemical Engineering. 2018, 22: 107-114. （病毒类生物制品的连续生产）
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