最新TFF应用集锦：昆虫细胞-杆状病毒系统、腺相关病毒（AAV）、大肠杆菌包涵体
1
来自奥地利自然资源和生命科学大学（BOKU）等的科学家们在2020年第38期的《Vaccine》杂志上发表了题为“Off-target effects of an insect cell-expressed influenza HA-pseudotyped Gag-VLP preparation in limiting postinfluenza Staphylococcus aureus infections”的文章。文中，流感Ha-Gag VLP以SFM4 昆虫细胞-杆状病毒表达系统生产，下游纯化操作时，先以0.65μm MidiKros® mPES中空纤维切向流过滤器进行预过滤，以去除杆状病毒灭活形成的沉淀。经微滤处理的上清液使用500kD MidiKros® mPES中空纤维过滤器浓缩约5倍，再以0.2X PBS洗滤4DV，最后再进一步浓缩约3倍。
摘要：临床和历史数据显示流感病毒具有与金黄色葡萄球菌（S.aureus）联合而使宿主易于发生继发性细菌性肺炎的能力，这也是流感相关致死率的一个主要原因。根本原因是目前还没有针对S.aureus的疫苗，而耐抗生物菌株的数量却在惊人地增加。所以，抗流感免疫成为了预防感染流感后出现葡萄球菌感染的唯一策略。在本研究中，我们评估了Tnms42昆虫细胞表达、经BEI处理的表达A/Puerto Rico/8/1934（H1N1）的HA的Gag-VLP制剂在防止以同源或异源H1N1病毒挑战株预感染小鼠中S.aureus重复感染的脱靶效应。结果表明，VLP制剂诱导的抗血凝素免疫足以防止致死性继发细菌感染所导致的致病和致死率。该效果即使在每个动物仅给予50ng HA的单次低抗原剂量下也能观察到。但是，仅诱导抗血凝素免疫无助于抑制异源病毒复制和随后的细菌感染。我们的结果从免疫源性角度证实了VLP疫苗方法的潜力，但是也说明抗HA免疫不能作为对抗流感和流感感染后细菌感染的唯一预防方法。
原文：M.Klausberger, I.A.Leneva, A.Egorov, et al., Off-target effects of an insect cell-expressed influenza HA-pseudotyped Gag-VLP preparation in limiting postinfluenza Staphylococcus aureus infections. Vaccine, 2020, 38: 859-867.
2
来自法国南特大学和德国Coriolis Pharma等的科学家们在2019年的《Journal of Pharmaceutical Sciences》杂志上发表了题为“Intrinsic Differential Scanning Fluorimetry for Fast and Easy Identification of AAV Serotypes”的文章。文中，rAAV载体使用HEK293细胞生产，并使用Repligen的300kD mPES切向流过滤器进行纯化及换液。
摘要：重组腺相关病毒（rAAV）载体由于其良好的安全性、高转导效率以及在非分裂细胞中的长期基因表达，已经成为基因治疗最有前景的技术。基于AAV的基因治疗在治疗遗传性疾病方面具有很大的潜力，如先天性失明、肌肉萎缩或出血性疾病。目前有多种天然存在的和工程改造的AAV血清型，其衣壳序列不同，继而细胞趋向性各有差异。各个AAV衣壳的热稳定性不同，并具有特征性的熔融温度（Tm），从而可对AAV载体进行血清特异性的区分。差示扫描荧光法（DSF）结合染料，如结合至未折叠蛋白质疏水性区域的SYPRO Orange（SO-DSF），可成功应用于确定AAV衣壳的Tm。这里，我们提出将本征荧光信号（iDSF）的DSF检测作为AAV衣壳Tm确定的简单替代方法。研究证实，iDSF是一种简单、准确且快速的SO-DSF替代方法，可鉴定AAV衣壳稳定性，具有出色的精确性，而不需要SO或任何其它染料。
原文：R.Rieser, M.Penaud-Budloo, M.Bouzelha, et al., Intrinsic Differential Scanning Fluorimetry for Fast and Easy Identification of AAV Serotypes. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2019, https://doi.org/10.1016/j.xphs.2019.10.031.
3
来自奥地利应用科学大学等的科学家们在2020年2月的《Journal of Biotechnology》杂志上发表了题为“IGF1 inclusion bodies: a QbD based process approach for efficient USP as well as early DSP unit operations”的文章。文中，实验室规模放大研究中的TFF浓缩步骤使用Repligen的KrosFlo® KR2i TFF系统结合5kD、115cm2 MidiKros®中空纤维过滤器进行，并在浓缩后进行缓冲液置换。
摘要：E.Coli是一种极具吸引力的重组蛋白表达载体，其以可溶性蛋白或包涵体（IB）形式表达产物。IB不可溶，大多为无活性的聚集体。但是，近期的研究进展已可有效地将其重折叠至其生物活性结构。根据IB生产的特点，如高产量、纯度以及分离简单，设计了针对性的生产工艺。基于质量源于设计（QbD）的工艺开发需要对工艺更深入的了解，以揭示各个相互作用的参数，这可使简化和加速上、下游工艺策略成为可能。这里，我们通过实验设计方法，提出了一种用于获得更深层次工艺理解的工作流程，以相对于杂质浓度，提高IGF1 IB的形成。在pH 6.5、37℃且>45 μmol gDCW-1 IPTG诱导12h时，IB表达最高19.8mgIGF1/gDCW。之后，结合阴离子交换吸附过滤器组件，测试了三种复性缓冲液。缓冲液选择可实现较高的杂质log降低值（LRVEndotoxin=4.9；LRVDNA=4.8，LRVHCP=0.1-1），且使用这些吸附基质可能可保护层析柱。此外，吸附过滤结合切向流过滤是一种非常有潜力的产物浓缩方法。
原文：K.F.J.Metzger, W.Padutsch, A.Pekarsky, et al., IGF1 inclusion bodies: a QbD based process approach for efficient USP as well as early DSP unit operations. Journal of Biotechnology, 2020, https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2020.02.014.
更多阅读
细胞灌流培养：连续生物生产 I & II | Q&A | 经济性分析 | 混合工艺 | CHO | 单抗 | 病毒性疫苗 | 强化工艺 | 规模放大 | 稳态 | 种子扩增 | 高产量收获 | 融合蛋白 | 工艺效率 | 工艺开发 | 一次性使用 | 高细胞密度培养 | 流感病毒 | PBG.PK.2.1 | 两步程序 | Sanofi | 工艺建模 | Samsung | N-1 灌流 | 补料分批 | T细胞治疗 | 逆转录病毒 | HEK293 | 经济模型 | 关键质量属性 | BHK-21 | 寨卡病毒 | 培养基 | 双特异性抗体
TFDF™：慢病毒 | 澄清 | Oxford Biomedica | 基因治疗
层析：预装柱适用性 | Q&A | 设计特点 | 装柱质量 | 除病毒验证 | 离子交换 | ValiChrom | MiniChrom | 捕获层析 | CHT | ADC | 病毒样颗粒 | MabSelect Sure | ELISA | 工艺开发 | RoboColumn | Atoll | 规模放大 | NGL-Impact A | Praesto Jetted A50 | CaptivA
UF/DF：基因治疗 | 病毒载体 | 慢病毒 | 水泡口炎病毒VSV | 埃博拉病毒 | 巨细胞病毒载体 | 慢病毒样颗粒 | 细菌外膜囊泡 | SIUS-Gamma | ADC | 纳米颗粒 | 离心 | 腺相关病毒AAV | 聚合物囊泡 | 外泌体 | 澄清 | 脂质体 | 细菌 | 一次性使用 | 平板膜包 | TangenX | 溶瘤病毒 | 痘病毒 | 疱疹病毒HSV | 环境科学 | 登革热病毒 | 呼吸道合胞体病毒RSV | CAR-T | 质粒 | 血红蛋白 | 冠状病毒 | 疫苗 | 封闭系统
SoloVPE/FlowVPE：C Technologies | 实时滴度监测 | 质粒 | mAb | 基因治疗 | 斜率光谱法 | PAT | FlowVPE
透析：中空纤维测试法 | 体内活性筛选 | 动态透析 | Spectra/Flo | 体外溶出 | 透析 | Q&A
TangenX™ 平板膜包工作原理
Spectrum®中空纤维工作原理
KrosFlo® KR2i TFF系统工作原理