下游连续生物工艺的动态控制策略
连续工艺是一种灵活的生产方法，可实现高产量、简化技术转移并促进从临床到商业规模的放大。与基于传统不锈钢设备的设施相比，运行连续工艺的设施报告具有更高的成本效率。由于连续工艺可以长时间运行，生产商必须实施污染风险管理方法和策略，来处理设备故障和关键过程参数 (CPP) 的偏差。
建立对生物生产工艺的控制并将其保持在受控状态，是美国食品和药物管理局 (FDA) 的工艺验证指南规定的目标。行业已经提出了不同的方法来纠正过程偏差，包括实现质量源于设计 (QbD)、进行适当的培训和使用实时分析工具。其它策略包括利用多变量分析监控和数字孪生，进行工艺建模，以及改进对关键质量属性 (CQA) 的控制。
理想情况下，连续工艺的所有部分都将以相同、协调的速度运行。但是可能会发生故障、中断和容量溢出。除了实施分析方法和监测工具外，一些生物生产商还使用小型缓冲罐来停止或暂停工艺，以便操作员可以维修设备并解决检测到的故障，而不会中断整个连续工艺系列。在 2022 年 3 月在美国加利福尼亚州圣地亚哥举行的 BPI 会议和展览上，Garmia Thakur（位于德里的印度理工学院生物制药技术卓越中心的 Anurag Rathore 教授实验室的研究员）展示了“mAb连续生产中，下游单元操作的动态控制策略”。以下是她演讲内容的摘要，然后是记者与她讨论了连续工艺的广泛实施、动态控制系统的好处以及开发此类系统时的主要考虑因素。
Thakur的演讲
连续生物工艺一直是一个备受关注的领域，因为它能够显著降低与生物治疗药物生产相关的成本。与传统的批次模式操作相比，连续生物工艺减小了设施规模，降低了可想象的耗材要求，并提高了整体工艺生产力。总体而言，与批次模式相比，连续工艺预计可节省 60-80%。一系列商业化赋能技术可用于连续工艺。用于生产单克隆抗体 (MAb) 的典型连续工艺平台始于灌流细胞培养反应器或补料分批细胞培养。随后是连续澄清（例如，使用声学废液分离 (AWS) 或连续离心）、连续层析、连续病毒灭活（在双罐或管式反应器系统中）、连续精纯层析，最后是使用在线浓缩器和在线洗滤组件的单程制剂。
下游连续工艺中带称量单元的缓冲罐（绿色）
这些赋能技术在商业上是可用的，足以在稳态下运行稳健的连续工艺 - 输入流量、滴度和质量属性没有变化，也没有设备故障。但是，当单元操作中出现问题时，比如连续工艺运行数周或数月，产品和/或过程变量可能会出现偏差。所以，如果一个固定的输入经过一个固定的过程，那么就达到了一个固定的目标输出。但是，如果一个可变的输入通过相同的固定过程运行，则最终产品的质量可能会受到影响，从而可能导致药物失效。
动态控制的过程将根据输入变化进行调整，以保持固定的目标输出。该目标符合 FDA 的指导方针，后者鼓励通过设计内置质量，这对于连续工艺很重要。这是因为在一个所有东西都连续流动的固定单元操作中，没有调整批次输出的余地。因此，在连续链的每一步都需要动态控制。
将动态控制构建到连续工艺中的一种方法是实施缓冲罐(图1)。在实验室中运行连续链后，我们的团队发现缓冲罐对于应对不同的过程问题是必不可少的。
内置安全和控制：层析等单元操作本质上是周期性的，并且具有多个连续步骤，其中上样或洗脱是不连续的。即使增加了层析柱的数量或安排了连续上样或连续洗脱步骤，也总是需要通过在层析步骤之前或之后设置保留体积来处理一些周期性。这些罐还可用于平均化工艺流中的变化（例如，浓度、盐和 pH 梯度）。缓冲罐还有助于降低整个工艺流程的操作压力，并在发生故障时允许一定暂停时间。
缓冲罐的放置对于实现连续工艺的动态控制很重要。下面的三个示例说明了我们如何使用缓冲罐来实现稳态工艺、抑制浓度梯度以及实现动态控制。
实现稳态工艺：可以采用缓冲罐来安排连续工艺的启动和关闭。一组称重天平或液位传感器将放置在每个缓冲罐下方。一旦储罐填充到设定点，将开始下一个单元操作。将执行颠倒顺序以关闭流程。此策略将在开始新的运行系列时执行。
抑制浓度梯度：当一个新的层析洗脱液被收集时，在缓冲罐中可能会发生浓度变化。如果缓冲罐是空的(没有洗脱液在该罐中)，并且从Protein A亲和层析中收集了洗脱液，那么缓冲罐内的浓度会急剧增加。然而，如果池中只有1洗脱液，那么浓度变化就会明显减弱。随着更多的洗脱体积等待在池中，抑制效应变得更加明显。对于池中的4个保留体积，我们的结果显示，对于4或更多洗脱的保留体积，存在<5%的变化 (平均浓度10.7 g/L 变化<0.5 g/L)。这意味着下一个单元操作(即病毒灭活)的进样物料几乎是一致的，与洗脱峰的时间点无关。因此，浓度梯度被抑制，使下一个单元操作顺利运行。
动态控制：我们还使用缓冲罐来动态控制连续链的稳态运行。在零时间点，我们的团队获得了补料分批材料，并使用 AWS 开始澄清步骤。我们在第一个缓冲罐中收集澄清的收获液，直至设定点。一旦该罐达到设定点，相当于上样材料的一个保留体积，我们开始将材料上样到Protein A 亲和层析柱中。然后我们匹配那个罐的流入和流出。AWS 的流入量、Protein A 柱的流出量和罐液位在接下来的连续运行中保持稳定。
开始上样到Protein A 亲和柱后，我们开始将洗脱液收集到下一个罐（缓冲罐 2）中。一旦我们收集了4洗脱液（根据阻尼因子分析的结果决定），我们开始阳离子交换层析 (CEX)。因为罐2管理从Protein A 柱的流出和CEX的流入，罐体积也保持在平均值，两个步骤的物料平衡独立发生。然后，我们再次开始在第三个缓冲罐中收集精纯层析的洗脱液。我们进行了几个制剂循环，等待第3个缓冲罐达到其设定体积，然后处理该材料，冲洗掉保留物，并在整个运行的其余部分重复该循环。
偏差的动态控制：缓冲罐的主要用途是处理工艺偏差。来自不同下游单元操作的故障模式和影响分析 (FMEA) 的结果提供了潜在故障列表。对于几乎所有情况，建议采取的措施 - 事实上也是唯一可能采取的措施- 是停止操作并进行不同的更改，例如更换层析柱、膜清洗循环或传感器。对于这种情况，理想的情况是在不需要停止整个工艺链并清除其中所有材料的情况下进行修正，从而实现动态控制。我们进行了三项研究，展示了如何使用缓冲罐让操作员能够处理连续澄清、Protein A 亲和柱和超滤-洗滤(UF-DF) 组件中的故障，而无需停止整个下游工艺。
连续澄清故障：在这项研究中，传感器检测到第一个缓冲罐的浊度增加，表明连续澄清存在错误。由于使用了缓冲罐，我们立即暂停了连续澄清设备的泵。因为我们在缓冲罐中已经有一定量的保留物料，所以我们继续上样至Protein A 直至其完整的循环并洗脱 CEX 直至其完整的循环 (ST03)。然后，修复的暂停时间“渗透”到整个连续链中，而不会影响层析上样，也不需要排空整个装置。一旦我们进行了所需的更换，我们就重新开始进行澄清 - 一旦达到设定点，工艺链的其余部分就会以稳健的方式继续进行。
Protein A 柱的故障：在另一项研究中，暂停一个连续工艺以纠正Protein A 柱的问题。我们立即将上样切换到备用柱 (ST01)。然后，因为我们在该柱中检测到一些故障，我们没有收集洗脱液。我们没有运行 CEX 循环 (ST03)，并且我们在整个工艺中遇到了延迟。该工艺被延迟，但关键质量属性 (CQA) 没有变化，也不需要排空整个设置。
UF-DF组件中的故障：在这项研究中，检测到并修复了压力偏差。我们暂停了 UF-DF 循环，并继续从 CEX 柱(ST03) 收集洗脱液，而无需停止之前的操作，时间根据我们的需要进行。我们需要大约5个小时来修复那个 UF-DF 组件。在那之后，我们处理了多余的物料，这些物料被保存在第三个缓冲罐中。
工艺属性的实时控制：缓冲罐最有趣的功能之一是它们提供了灵活性，可以采用不同的控制策略来处理过程属性的变化。这种变化包括滴度问题、聚体含量的变化以及来自上游生物反应器的物料的电荷变化分布的变化。
近线高效液相色谱 (HPLC)：我们的团队进行了一项研究，使用缓冲罐来处理电荷异构体成分的变化。第一步是配备一个分析工具，可以连续监测精纯层析上样和洗脱过程中的电荷异构体。将我们的 HPLC 系统连接到制备层析设备，自动进样每4分钟从制备层析中连续抽取物料。
在该研究中，我们连续监测洗脱液流的聚体和电荷异构体含量。使用三维 (3D) 图，我们监测有多少电荷异构体进入洗脱池。如果我们检测到偏差，那么我们会相应地调整池，以确保我们的电荷异构体分布不受影响。因此，使用近线 HPLC 的交叉分析工具帮助我们根据在电荷异构体上样中检测到的偏差做出合并决策。一旦近线 HPLC 到位，我们可以通过调整精纯层析的合并来控制电荷异构体分布。然而，因为我们收集了更小或更大的峰部分，所以洗脱池的浓度存在偏差，这会导致 UF 步骤出现问题，如下所述。
用于浓度检测的在线近红外光谱 (NIRS)：在我们的研究中，我们使用 NIRS 传感器连续定量 UF-DF 进样的浓度。我们使用 NIR 是因为我们发现它是一种强大的入线浓度传感器。它可以使用 0.5–200 g/L 范围内的化学计量模型进行校准，并且可以在几秒钟内定量浓度。一旦我们安装了浓度传感器，我们就在我们的连续 UF-DF 步骤上设置了一个控制。在第一个物料罐中，我们持续监测浓度。然后，我们可以调整进样流速、滤液流速和回流压力，以保持通过单程切向流过滤 (SPTFF) 组件的稳定通量。因此，即使对于不同的进样浓度，我们也可以调整UF-DF 的跨膜压力，以确保达到我们的回流浓度目标。
组合策略：将近线 HPLC 和入线 NIRS 控制结合在一起，我们可以在连续工艺中实施缓冲罐。我们启用了对精纯步骤和 UF-DF 步骤的控制，而无需在出现偏差的情况下停止整个工艺链。近线 HPLC 检测电荷异构体或聚体的偏差。我们调整了连续层析设备上的合并。这降低了洗脱池的浓度，其使用 NIR 检测到。缓冲罐的体积也减少了，其使用称重天平检测。最后，我们调整了 UF-DF的操作条件，以保持回流浓度。
我们将碱性异构体加标到来自补料分批反应器的进样物料中。每次精纯层析洗脱液都略小，并且罐的体积没有像在稳定液流操作期间那样升高。那是因为过量的碱性异构体触发了近线 HPLC，告诉我们收集较小的池。随着碱性异构体通过系统，池降低。我们还控制每个UF-DF 循环，以保持回流浓度，直到工艺恢复到稳定状态。
我们的对话
会前，我与 Thakur 就生物工艺行业采用连续工艺以及在此类工艺中实施动态控制的好处进行了交谈。
是什么推动了该行业采用连续工艺？如何减少下游瓶颈，更好地利用资源和物料？二十年前，“质量”是生物制药生产的主要挑战。由于 CQA 尚未完全定义，生产工艺处于开发的早期阶段，监管部门的批准也很缓慢。然而，从那时起，平台化生产工艺已成为许多类型生物药物的标准，包括单克隆抗体、激素疗法、胰岛素、白细胞介素和疫苗。现在，“质量”已经成为常态，公司已经接受了FDA 在 2004 年推广的 QbD 措施。
在生物制药行业竞争日益激烈的环境中，降低成本和加快上市速度已成为商业成功的关键。因此，该行业现在不仅要重视质量，还要重视成本效益。连续生产似乎是实现根本性成本改进的一种方式。学术和工业团体都进行了广泛的经济分析和案例研究，估计通过从批次生产转向连续生产，资本成本可降低达 80% 以上，商品成本可降低达 60% 以上。生物治疗药物的典型生产过程包括多个上游和下游单元操作，从细胞培养开始，然后是层析纯化、除病毒和制剂。在批次模式下，在每个单元操作后，离线存储和分析过程中的物料，由于设备和存储罐较大，导致大规模的工厂占地面积和较长的处理时间。顺序调度导致设备使用效率低下，停机时间长。相比之下，连续工艺将单元操作与不断流动的工艺流集成在一起。
通过利用具有多通道、多泵和多阀技术以及先进工艺调度的一系列技术赋能因素，可将批次模式操作转换为连续操作。总体而言，连续工艺可以在更小的工厂占地面积和更低的非生产时间内，实现与批次工艺相同的物料吞吐量。其它优势包括层析柱更小、操作循环次数更多、从而改进层析填料的利用率、缓冲液体积减少、操作员要求更低、过程中生物治疗药物的停留时间更短，以及在恒定关键工艺参数 (CPP) 下实现稳态操作的能力，获得一致的输出 CQA，避免批次间的可变性。
一些研究人员指出了连续的上游和下游进步之间的差距。您对此有何看法？连续上游工艺的进步肯定比连续下游工艺的进步要大得多。有利于连续工艺的最关键进步之一是现代化灌流生物反应器系统的出现。在最近报道的案例中，将这些与高产量克隆相结合，使得mAb的连续上游生产滴度能够高达 30 g/L。上游产能的增长如此显著，以至于下游的纯化工艺越来越被称为“瓶颈”。
在将下游操作从批次模式转变为连续模式并消除下游工艺瓶颈的赋能技术的开发方面已经取得了进展。这些进步包括具有更高结合载量和改进分离机制的新型层析填料，多柱层析的应用，其可实现串联柱的过载，入线浓缩器的整合，其可降低过程中体积，以及增加膜面积，以促进单程制剂。
然而，下游工艺链在连续工艺方面落后的一个原因是，有许多单元操作必须无缝集成，包括捕获、病毒灭活、多个精纯步骤、除菌过滤以及制剂步骤。这与上游工艺形成对比，后者本质上只是生物反应器的单个单元操作，直接与澄清系统耦合，例如交替式切向流过滤（ATF）。特别是，由于难以对应生物反应器输出物料中的潜在可变性，因此很难将大量下游步骤与上游生物反应器“衔接”。这种偏差包括 MAb 滴度或糖基化谱的可变性。用于下游单元操作的稳健集成、监控和控制的工具有限，难以确保它们可以在长时间连续的操作中可靠地运行，同时保持最终药物产品的一致输出质量。
动态控制系统有什么好处？它们允许实时更改吗？连续工艺中存在许多潜在的可变性来源。在上游灌流过程中，可以预期滴度在整个运行过程中每天都在变化，并且灌流液流中的最低和最高滴度之间的差异通常为 150 - 500%。可变性在工艺的早期和后期阶段特别常见，因为细胞活性在生物反应器中增加然后减少。到目前为止，大多数关于端到端连续工艺的研究都没有深入考虑这个问题，因其使用补料分批细胞培养或低滴度 <1 g/L 的灌流条件。在下游单元操作中，上游生物反应器的来料变化和下游步骤中的工艺偏差可能会引起许多变化，包括层析柱中的填料污染、柱压缩或失效、膜污染、深层过滤器堵塞、压力升高、 pH 维持问题、电导率变化、入线浓度梯度等。
非常有必要开发一种用于下游操作的动态控制系统，该系统可以适应滴度可变性和过程可变性，同时保持连续性、生产力和稳健性。正如我在演讲中所描述的，控制系统的一个关键赋能因素是使用缓冲罐，其在单元操作之间保持少量物料，以防止它们在前面步骤中出现意外偏差或设备故障的情况下“干涸”。罐还可分离单元操作，并允许使用 QbD 和 PAT 方法对每个单元操作执行独立控制。这样的控制系统将克服连续工艺中一个尚未探索的关键挑战，即与下游工艺链“衔接”，同时通过在所有各种下游单元操作中做出实时控制决策，来适应可变的上游条件。下游生产线的这种自动化灵活性是实现连续操作的关键要求，即使物料属性或工艺参数发生变化，无需人工干预也可实现连续操作。
在实施这样的系统之前，主要考虑什么？该策略要求使用中央控制器集成和自动化所有单元操作。该策略还需要一个传感器，用于实时或接近实时地频繁监测生物反应器的收获滴度，以便可以跟踪滴度变化和工艺偏差，并相应地调整下游单元的操作。此类措施将防止物料损失并修改 CPP，以确保在每个下游步骤中满足 CQA。来自所有单元操作和浓度监测传感器的数据应集中并由控制算法读取，以促进实时控制决策。
总体而言，一个工艺应该很好地表征，并且应该很好地探索上下游每个步骤的设计空间和操作空间。这样的准备工作将确保可以针对不同的过程条件制定最佳响应策略，并且可以将自动化指令编码到中央控制器中。
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原文：M.Rios, G.Thakur, A dynamic control strategy for downstream continuous bioprocessing. Bioprocess International, 2022.
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