RNA治疗药物的纳米级递送平台：临床开发中的RNA纳米颗粒
往期相关文章：“RNA治疗药物的纳米级递送平台：有效递送的障碍” 以及 “RNA治疗药物的纳米级递送平台：递送材料的设计” 。
安全且有效的 RNA 递送系统的开发推动了第一个临床获批的 RNA 纳米疗法，以及令人兴奋的人体数据，显示出了它们在一系列治疗应用中的潜力。例如，非病毒mRNA 递送载体显示出使基因编辑成为肝脏相关疾病的一次性治疗方法和新疾病的蛋白质替代疗法的潜力，并为更智能、更有效的疫苗打开了大门（图 3）。在本文中，我们将针对 RNA 纳米颗粒的一些极有希望的进展进行回顾。
治疗产物表达和蛋白质抑制
从历史上看，最适合在全身递送时体内递送外源性RNA 的器官是肺和肝脏。已经有研究报道了使用聚合物和脂质纳米颗粒将siRNA 和 mRNA 有效递送至肺内皮，以及在经纳米颗粒介导的靶向 CD31、VEGFR 或DLL4 的 siRNA 递送至肺内皮后在转移性肺癌小鼠模型中的治疗效果。除了内皮，靶向肺免疫细胞也可能具有治疗相关性，特别是在急性肺损伤模型中。例如，当使用树枝状纳米颗粒通过鼻滴注将其递送至肺巨噬细胞时，已显示出抗TNF-α siRNA 在 LPS 诱导的急性肺损伤模型中可显著减轻炎症。
图3. mRNA治疗应用：NP 介导的mRNA 疗法的三种应用概述：蛋白质替代疗法（显示治疗性抗体的生产）、使用可编程核酸酶进行基因编辑和mRNA 疫苗。
肺中的上皮细胞也是一个有吸引力的目标，特别是用于治疗囊性纤维化。多项研究现已表明，CFTR-/-小鼠中，使用人囊性纤维化跨膜电导调节剂 (CFTR) 编码 mRNA 的蛋白质替代疗法可以通过鼻内给药的LNP 或静脉内或气管内给药的 PLGA 纳米颗粒，改善肺功能和部分恢复正常 CFTR 活性。有趣的是，LNP 介导的编码失活上皮钠通道(ENaC) 亚基的 mRNA 的递送也显示出治疗效果，表明 ENaC 的下调也可以为囊性纤维化提供治疗；ARO-ENaC，一种靶向 EnaC 的 siRNA 偶联物，目前正在正在研究1/2a 期临床试验。虽然这些研究主要使用NP 溶液的气管内注射或鼻内滴注，但 PBAE NP 可以在吸入雾化 NP 溶液后促进mRNA 向肺中的上皮细胞和内皮细胞的递送。最近，Lokugamage等人还证明了由 7C1 组成的混合聚合物-脂质纳米颗粒，以及由cKK-e12 和 MC3 组成的 LNP，可用于在吸入雾化NP 溶液后递送 mRNA。目前，进行中的 MRT5005 I/II 期临床研究正在评估使用这种方法递送CFTRmRNA，以用于治疗囊性纤维化。
在过去十年中，向肝脏递送 siRNA 的疗法已得到很好的表征。例如，所有三种已在美国获批用于临床的 siRNA 药物（Onpattro、Givlaari和 Oxlumo）均通过沉默肝细胞中的蛋白质生产而起作用；其它还有多种靶向肝脏的 siRNA 疗法目前正在临床研究当中。将治疗性 mRNA 递送至肝脏的策略主要集中在使用肝细胞作为“仓库”，大量的蛋白质可在递送后翻译并随着时间的推移而释放，从而产生持续的效力。这种方法已成功用于治疗小动物模型中的许多疾病，包括血友病 B、精氨酸酶缺乏症和急性间歇性卟啉症等。该策略也可用于在体内直接产生中和抗体以防止病毒感染，或针对肿瘤相关抗原的抗体。例如，用包封编码VRC01 的 mRNA的LNP预防性治疗小鼠，VRC01是一种抗 HIV-1 中和单克隆抗体，使用两种不同的 HIV-1 毒株防止静脉内攻击。作者指出，用 30 mg VRC01 mRNA LNPs 处理的小鼠的循环抗体水平高于用 600 mg 单克隆抗体处理的小鼠，这强调了转染肝细胞在转染后产生和分泌大量蛋白质的能力。Rizvi等人最近证明，肝细胞定向的 mRNA 递送也可能与对抗慢性肝病有关；在非酒精性脂肪性肝病和急性肝损伤模型中，发现递送编码肝细胞生长因子和表皮生长因子的mRNA可瞬时诱导肝细胞增殖并加速恢复。
从历史上看，向肺内皮和肝脏以外的组织进行全身给药一直具有挑战性，但最近在筛选策略和改进的纳米颗粒设计方面取得的进展已经开始改变这一点。例如，使用DNA 条形码在迭代过程中筛选纳米颗粒介导的siRNA 功能递送产生了一种聚合物-脂质纳米颗粒，该纳米颗粒被发现在骨髓内皮细胞中的蛋白质敲除效率几乎是原始配方的 5倍，打开更精确地操纵造血的潜在疗法的大门。改进的材料还能够将RNA 递送到特定的免疫细胞，为直接的体内免疫疗法铺平了道路。在最近的一个例子中，Parayath等人使用抗 CD8 抗体偶联的 PBAE 纳米颗粒将编码嵌合抗原受体(CAR)的mRNA 递送至体内循环 T 细胞；由此产生的瞬时CAR T 细胞能够减少肿瘤负荷并改善多种肿瘤模型的结果。这些结果，以及其它开发了体内 T细胞特异性递送平台的研究，为直接在体内设计免疫系统的现成药物打开了可能性。除了循环和细胞质递送外，还通过局部给药实现了对器官（例如眼睛和大脑）的递送，一些研究已经实现了全身给药后递送至脑实质。值得注意的是，最近的一项研究利用葡萄糖转运蛋白 1介导的跨血脑屏障摄取和转胞吞作用，通过使用糖基化聚合物纳米颗粒递送靶向BACE1 的 siRNA，从而减少阿尔茨海默病小鼠模型中的抗体斑块形成。Patel 等人也说明了 LNP 介导的mRNA 递送，在其一项研究中，系统地比较了可电离和阳离子脂质在视网膜下注射后靶向转染视网膜色素上皮细胞，这可能有望用于开发治疗年龄相关性黄斑变性和青光眼等疾病。
基因编辑
包括 CRISPR/Cas9、锌指核酸酶 (ZFN) 和转录激活因子样效应核酸酶(TALEN) 在内的可编程基因编辑器的进展尤其令人兴奋，因为它们可以通过在基因组中引入位点特异性突变为许多疾病提供单一治疗方法。这些基因编辑器能够与预定的DNA 序列结合，编程为 ZFN 和 TALEN 的特定氨基酸序列或CRISPR-Cas 系统的伴随 gRNA，并切割结合 DNA 的一条或两条链。产生的单链缺口或双链断裂(DSB) 随后可以通过许多 DNA 修复途径解决，其可以产生半随机插入缺失突变或通过同源定向修复 (HDR) 进行精确编辑，具体取决于修复模板以及许多其它因素的存在与否。
Cas9 mRNA 和gRNA 可以使用合成纳米颗粒在体内递送，以实现有效的基因敲除和敲入。2016 年，腺相关病毒 (AAV) 被用于递送 gRNA 和修复模板以及一种LNP 用于递送 Cas9 mRNA，从而通过 HDR 校正FAH 基因座处的剪接位点突变，治疗 I 型酪氨酸血症的小鼠模型。后来的研究表明，通过在糖-磷酸骨架的特定位置掺入化学修饰来稳定 gRNA 可以显著提高体内基因编辑效率。含有 Cas9 mRNA 和两种化学修饰 gRNA 的单剂cKK-e12 LNP 足以破坏 PCSK9 基因座 83% 的基因，导致血清胆固醇水平降低35%。一项使用ZFN进行的研究发现，使用携带 HDR 供体的AAV和 ZFN mRNA LNP进行结合治疗也导致体内肝细胞中高水平的治疗性转基因产生；此外，作者发现ZFN mRNA LNP 可以在低至 0.05 mg/kg的剂量下介导高效基因编辑。最近，Rosenblum 等人描述了在小鼠胶质瘤和卵巢腺癌移植瘤模型中的高效基因编辑，在两种肿瘤中分别实现了68% 和 82% 的编辑率；在这两种模型中，作者发现给药含有靶向 PLK1 的 Cas9 mRNA 和gRNA 的 LNP 显著提高了存活率。纳米颗粒介导的预组装 Cas9-gRNA 核糖核蛋白 (RNP) 的递送也已被证明是一种可行的体内基因编辑方法。细胞的体外编辑以及随后移植到患者体内是体内编辑的一种替代策略，目前正在临床试验中进行研究。最近，NTLA-2001，第一个进入临床试验的体内 CRISPR/Cas9 治疗药物，在一项进行中的 I期临床试验中被发现在降低血清转甲状腺素蛋白(TTR) 水平方面非常有效，这表明 NP 介导的体内基因编辑系统递送可能很快成为罕见病患者的治疗选择。
治疗性基因编辑系统的开发部分受到许多安全问题的阻碍，其中一些涉及将DSB 引入基因组。脱靶编辑和不希望的在靶编辑，例如编辑细胞中的大量缺失和杂合性丢失，可能会导致基因编辑疗法的意外副作用。作为替代方案，碱基编辑是一种使用Cas9 催化受损变体的方法，其中，相对于形成DSB，在胞嘧啶碱基编辑器 (CBE) 的情况下，融合胞苷脱氨酶(CBE) 或在腺嘌呤碱基编辑器（ABE）的情况下，腺苷脱氨酶，可以分别将附近的胞嘧啶转化为尿嘧啶或腺嘌呤转化为肌苷。在这种策略中，Cas9的催化受损变体，称为“切口酶”，仅切割目标 DNA 的单链，导致插入缺失突变少得多，因此，与DSB 介导的 HDR 相比，通常可以实现更高的相对精确编辑率。同样重要的是不需要 DNA 修复模板，这可以显著减少有效递送的障碍。LNP 介导的碱基编辑器的体内递送的临床前研究很有希望。没有显著脱靶编辑的高效 ABE 和 CBE 介导的基因校正已分别用于治疗 I型酪氨酸血症和苯丙酮尿症的小鼠模型，其使用LNP。最近，LNP 介导的碱基编辑递送也被证明在非人类灵长类动物(NHP) 中是安全和高效的，导致 PCSK9 基因座的碱基编辑率超过 60%，而没有任何副作用。使用市售的脂质转染试剂对预组装的碱基编辑器RNP 进行局部给药也已被证明可以编辑小鼠耳蜗中的有丝分裂后感觉细胞，从而促进细胞增殖。重要的是，当使用相同的策略来递送Cas9 RNP 和 DNA 修复模板时，没有观察到编辑，这表明碱基编辑可能是在有丝分裂后细胞中进行编辑的更可行的选择。
引物编辑已成为另一种选择，包括一个引物编辑器，它是一个与逆转录酶融合的Cas9 切口酶，以及一个 3’延长的 sgRNA，称为pegRNA，它包含一个引物结合位点和一个用于逆转录的模板。这种策略可能可允许对插入和缺失突变以及 SNP 进行模板化校正，同时仍然能够在不存在DNA 修复模板的情况下进行精确编辑。然而，尽管迄今为止已使用流体动力学注射和AAV证明了体内引物编辑递送，但尚未报道纳米颗粒介导的引物编辑递送。
mRNA疫苗
与传统疫苗一样，mRNA 疫苗以促进适应性免疫系统激活的方式将外源抗原递送至抗原呈递细胞 (APC)，例如树突状细胞 (DC)。要使mRNA 疫苗成功，它必须递送抗原并促进抗原特异性免疫细胞激活。目前正在开发的两大类mRNA 疫苗是自扩增（saRNA 或 SAM）和非扩增mRNA 疫苗。saRNA 疫苗包含源自自我复制单链 RNA 病毒的工程构建体，并编码抗原和RNA 依赖性 RNA 聚合酶 (RdRP)，后者在翻译后可以扩增整个构建体，同时还产生编码抗原的加帽和加尾的转录物。2016年，研究证实了树枝状纳米颗粒介导的 saRNA 递送可以提供针对 H1N1 流感、刚地弓形虫和埃博拉病毒的保护性免疫。Blakney等人还证明了在用几种不同的可电离脂质递送的saRNA 疫苗对小鼠进行免疫后，会产生 HIV-1 特异性抗体。saRNA 疫苗也被发现在NHP 中是安全的并具有免疫原性，且目前有多种自扩增候选疫苗正在研究中，包括SARS-CoV-2以及狂犬病和单纯疱疹病毒 2 疫苗。
传统 mRNA 疫苗的临床前研究集中在改善蛋白质翻译、促进 DC 成熟或两者兼而有之。虽然一些疫苗可能受益于由 TLR7 识别介导的 mRNA的“自佐剂”特性，但正如其他人所指出的那样，mRNA激活先天免疫可能是一把双刃剑，既能促进DC 成熟，又会降低抗原翻译。佐剂的共同递送，例如TLR 激动剂和 STING 的 mRNA 编码组成型活性突变体，已被证明可在维持高水平翻译的同时，影响DC 激活。作为替代方案，我们在 2019 年的一项研究中证明，使用含有 A18（一种本身是 STING 激动剂的可电离脂质）的LNP 递送 mRNA 疫苗可以导致有效的蛋白质产生，同时也促进免疫系统的有效激活；使用 A18 LNP 在体内将肿瘤相关抗原递送至 APC 可抑制肿瘤生长并改善多种肿瘤模型的结果，这表明将免疫原性整合到材料设计的早期阶段可以在mRNA 疫苗的开发中取得丰硕成果。
重要的是要注意，尽管对于大多数 RNA 疗法来说，全身免疫原性是不可取的，但特定免疫细胞的激活对于 mRNA 疫苗的成功是不可或缺的。正如前面部分所讨论的，RNA 和 PEG 脂质相关的免疫原性会导致蛋白质生产的抑制并降低重复给药的治疗效果，这两者都会严重限制mRNA 疗法的使用。相反，APC 激活是递呈 T 细胞介导免疫发展所要求的共刺激因子所必需的。因此，mRNA疫苗的设计通常可以被认为是一种平衡行为，其中必须优化不希望的免疫原性和目标免疫细胞激活的组合。
本文节选、翻译自以下文章，由于水平有限，详细内容，请参考原文。文章旨在知识分享，如有任何问题，请联系处理。
原文：L.H.Rhym,D.G.Anderson, Nanoscale delivery platforms for RNA therapeutics: Challenges andthe current state of the art. Med, 2022, 3(3): 167-187.
相关阅读：