工程外泌体：一种变革性的治疗方式
本文节选、翻译自来自Evox Therapeutics的研究人员发表的文章，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
利用外泌体的治疗用途可以彻底改变制药行业，通过解决重大挑战，例如以具有低免疫原性和允许重复给药的方式成功地将药物递送到多个组织。外泌体是由大多数（如果不是所有）细胞类型释放的小的脂质结合囊泡。它们发挥着一系列生物学作用，可以携带多种“货物”，这些“货物”可以输送到受体细胞的细胞质中。作为“自然的运载工具”，它们可以被设计成携带不同种类的治疗货物，从 RNA 到蛋白质，甚至病毒。在 Evox，我们正在解决利用外泌体作为治疗药物的许多挑战，方法是优化外泌体，以最大限度地装载一系列药物货物，规模放大这些外泌体的一致生产，以及通过设计外泌体来特异性靶向细胞类型，并克服限制性生物和生理障碍。
简介
外泌体是一种细胞外囊泡 (EV)，其物理定义基于其大小和细胞生物发生的方法。它们是由大多数（如果不是全部）细胞分泌的纳米级、脂质膜包裹的小囊泡（直径约 30-150 nm）。
外泌体最初发现于 1980 年代，它们开始被认为是从细胞中排出的简单废物。到 2000 年代中期，研究显示外泌体明显具有生物学功能，实际上能够促进蛋白质和 RNA 在细胞之间的穿梭。
外泌体（以及细胞外囊泡的其它亚群）代表了一种高度保守且先进的细胞间通讯系统，细胞通过该系统有效和安全地交换物质。EV已被证明能够自然运输各种细胞代谢货物，例如蛋白质、脂质、转录因子、miRNA 和 mRNA，正是外泌体作为“自然运载工具”的这种自然作用，导致了许多对其潜在治疗用途的开发兴趣。这种治疗兴趣大多集中在外泌体上，但在从生物学功能以及转录组学和蛋白质组学角度表征不同类别的 EV 方面仍有许多工作要做。其它类型的 EV，例如通过质膜或凋亡小体向外出芽释放的微泡，也可能具有治疗开发的潜力。
外泌体通过内体膜内陷形成内体多泡体（MVB），其与质膜融合，释放腔内囊泡，作为外泌体。EV的内容物、它们的特性和货物因参与其生成的细胞的类型和状态而异。它们可以包含源细胞的大分子物质，如蛋白质、肽、脂质、DNA、microRNA、长链非编码RNA和mRNA。相比之下，其它形式的 EV，例如微泡/脱落颗粒和凋亡小体（直径范围 > 100 nm）分别通过质膜的向外出芽或凋亡细胞死亡期间释放。
外泌体在细胞间保护和递送功能性大分子，包括核酸、蛋白质、脂质和碳水化合物，将它们的货物转移到受体细胞。如图1所示，外泌体将其货物运送到受体细胞的途径似乎与其它基于脂质的纳米颗粒 (LNP) 有根本性不同。外泌体似乎被丝状伪足吸收为单个颗粒，并花费大量时间与内质网相互作用，在此，假设一些货物被释放到细胞质中。
图 1 外泌体细胞摄取和内化途径似乎与脂质纳米颗粒 (LNP) 不同。
相比之下，LNP是球形人造囊泡（由可电离的脂质、辅助脂质、胆固醇和 PEG 脂质组成），通过内吞作用被细胞吸收，并且脂质在低 pH 值下的电离性使得一些货物内体释放进入细胞质。由于 LNP 的内在作用机制，包括定位和内体的破坏，通常会触发先天免疫识别传感器，需要用皮质类固醇对患者进行预处理和/或将化学修饰引入任何 RNA 药物货物以减少先天免疫识别。尽管 LNP 对 mRNA 递送很有效，但据报道外泌体比 LNP 更稳定且免疫原性更低。
外泌体在不同生物体中是保守的，几乎由所有细胞产生，因此存在于所有生物体液中。因此，外泌体大量存在于许多常规医药产品和程序中，例如输血和治疗性血浆交换，这支持了它们良好的安全性。此外，外泌体可以在不引发先天免疫反应的情况下递送包括 RNA 在内的多种药物货物。由于它们能够转移生物活性成分和穿过生物屏障（如细胞膜或血脑屏障），如表 1 所示，外泌体越来越多地被视为一种治疗方式，从而能够更广泛地用于 mRNA、RNAi 和基因治疗药物货物。多个小组也在研究外泌体作为细胞疗法替代品的能力。
表1. 不同治疗模式的特性
使用从不同细胞来源产生的非工程外泌体已经进行或正在进行十多项不同的临床试验。迄今为止，这些纯化的“天然”外泌体已在人体中显示出有希望的安全性，但有时在临床试验中缺乏足够的功效。
正如将在下一节中讨论的那样，多个学术团体和公司一直在寻求各种策略来设计外泌体，以包含更高水平的所需药物（通常将活性分子的水平提高几个数量级）。重要的是，从安全的角度来看，这些载药工程外泌体继续显示出出色的临床前安全性，截至目前，早期临床试验数据也证实了这一点。
工程外泌体作为潜在的治疗方法
为了开发强大的外泌体疗法，各个小组（包括 Evox Therapeutics）正在工程设计外泌体，以包含多种药物货物并靶向不同的组织。在开发外泌体治疗药物时，一个重要的考虑因素是产生外泌体的细胞的来源。在 Evox，我们筛选了许多潜在的外泌体生产细胞系，并确定了几种具有已知调控历史的合适人类细胞系。我们的方法是为所有患者使用单一的人类同种异体细胞来源，目的是使相同的细胞来源可用于多种不同的疾病应用。
目前，Evox 正在开发基于 CEVEC 的羊水细胞生产细胞系 (CAP®) 和人胚胎肾 (HEK293) 悬浮细胞来源的专有细胞系。其他小组正在开发专有的间充质干细胞系 (MSCs) 和诱导多能干细胞 (iPSCs)。除了监管历史之外，采购细胞系的一个重要考虑因素是确保其具有良好的特征并且可以通过可放大的工艺进行生产。在生产方面，选定的细胞系将组成型分泌外泌体到培养基中（通常每个细胞每天数千个外泌体），从中可以纯化外泌体并放置在小瓶中，以便以后进行患者给药。
图 2 概述了 Evox 的外泌体工程平台和从药物装载到最终外泌体纯化的生产过程。外泌体疗法开发的重大突破之一是能够工程设计外泌体，以包含高拷贝的药物货物。这可以通过以下方式完成：
外源性加载：预先纯化外泌体，然后将现有药物（如 siRNA 和小分子）直接加载到外泌体中。可以通过多种方式将药物装载到外泌体中； 内源性加载：生产外泌体的细胞也生产所需的药物，并以自然的方式加载到外泌体中。通过药物与大量表达的外泌体蛋白或其片段的遗传关联来实现加载。
在 Evox，我们采用了这两种方法，并且通常能够为每个外泌体加载数百到数千个特定药物的拷贝。如图 2 所示，根据所使用的工程方法，这些药物可以装载在外泌体表面（表面展示）、外泌体膜或外泌体腔中。使用 Evox 专有的 pH 切割连接器系统，可以将腔内加载的药物束缚在外泌体膜的内表面上，或者药物可以在外泌体腔内自由溶解。
图2. Evox 的治疗平台 - 我们的DeliverEX™ 平台与模块化生产方法相结合，实现了载药灵活性。
可以将多种不同的药物类型设计到外泌体中或外泌体上，几乎涵盖了所有药物模式（图 3）。也可以将不同类别的药物加载到同一个外泌体中，这是我们在使用靶向 CNS 的外泌体将 siRNA 系统性地递送到大脑时已经采用的方法，我们现在正在通过将 CRISPR-Cas酶与引导 RNA 一起加载入外泌体，以在基因编辑环境下进行研究。一旦载有药物的外泌体被吸收到所需的靶细胞中，货物就会被释放到受体细胞中。
图 3 可用于外泌体的潜在治疗性货物示例。
外泌体治疗的疾病应用
在动物模型中可以递送并已在体内显示有效的药物货物类型包括 RNA 治疗剂 （siRNA、反义寡核苷酸、microRNA、mRNA）、蛋白质（如受体、酶、抗体和肽）以及小分子。Matthew Wood 教授的研究小组首先报道了外泌体在体内包含和递送药物的工程，并且这种方法已经被各个小组扩展，包括将不同的药物有效载荷递送到各种组织。最近的文章强调了外泌体在其表面有效展示治疗性分子（如 IL-12 和 TNF/IL6 拮抗剂）的潜力。Evox 的联合创始人 Matthew Wood 教授和他的团队在2011年的一篇具有里程碑意义的 Nature Biotechnology 论文中首次证明，外泌体还可以被设计为在其表面展示配体，以便将外泌体靶向特定的受体细胞类型或促进跨越生理屏障。正在开发的方法依赖于多模块工程策略，其中一种外泌体蛋白质用于实现药物装载，另一种蛋白质在外泌体表面赋予靶向部分。
开发基于外泌体的疗法来治疗多种疾病可能会通过将蛋白质生物药和基于核酸的疗法递送到目前其它药物递送技术无法实现的细胞和组织中来彻底改变制药行业（图 4）。基于外泌体的疗法正在考虑的变革性治疗应用包括外泌体通过通常受限的屏障（例如血脑屏障）递送蛋白质和核酸以进入大脑的能力，外泌体功能性递送药物（例如抗体）进入细胞质的能力，外泌体允许基于 AAV 的基因疗法重复非免疫原性给药的能力，以及将 RNA 药物的范围扩展到肝脏以外的组织和局部应用的能力。已经有了许多更新的先进疗法，例如 RNA 干扰、mRNA、AAV 基因疗法和基因编辑平台，药物的设计不再是主要的限制因素，而是无法将它们递送到正确的细胞或位置。通过这种方式，外泌体疗法提供了显著改善各种已经建立或容易获得的药物的可能性。
图4. 工程外泌体用于创造转化药物。 (A) Evox的外泌体被设计成能够装载各种货物。 (B)工程外泌体的应用和优势。
基于外泌体的疗法可以产生变革性影响的一个领域是治疗罕见的遗传性疾病。在最近发表的工作中，外泌体已被用于改善许多罕见疾病的预后。例如，已证明外泌体介导的剪接-校正寡核苷酸递送可显著改善肌营养不良蛋白的产生，并导致杜氏肌营养不良症小鼠模型的功能改善。在这个例子中，外泌体介导的剪接-校正寡核苷酸的递送导致 mdx小鼠中抗肌萎缩蛋白的野生型水平恢复了 10-20%，而单独添加等摩尔量的寡核苷酸时校正为 1-2%。
外泌体疗法治疗罕见代谢和溶酶体疾病的潜在优势之一是能够反复给药外泌体负载药物，根据需要给药或撤药，装载各种大小的药物货物，以实现同时分布到多种不同的组织或细胞类型，并利用有利的安全性将其应用于更广泛的罕见疾病。相对于其它提供基因治疗和基因编辑的方法，这些外泌体递送药物的优势是不同的。在 Evox，我们正在工程设计外泌体，以实现治疗性蛋白质、核酸或基于 AAV 的基因治疗的特定负载，目的是使用这些工程外泌体作为遗传代谢和溶酶体疾病的潜在疗法，例如苯丙酮尿症 (PKU)、精氨酸琥珀酸酸尿症 (ASA)、瓜氨酸血症 I 型和 Niemann Pick-C 型。
此外，基于外泌体的疗法还可以在罕见疾病之外具有广泛的适用性。已发表的体内临床前研究表明，靶向大脑的外泌体可用于将针对α-突触核蛋白和 Mu 阿片受体的RNAi 药物递送到大脑，分别用于治疗帕金森病和吗啡依赖性。其它潜在的帕金森氏症药物，如氧化还原酶过氧化氢酶，已使用外泌体成功递送到大脑。在其它应用中，非靶向外泌体和肿瘤靶向外泌体均已被证明可递送 RNAi 药物，从而提高胰腺癌和前列腺癌小鼠模型的存活率并降低肿瘤。其它已发表的体内研究表明，外泌体能够改善小分子药物（如姜黄素、多柔比星和紫杉醇）向肿瘤的递送。
最近，临床前报告表明，外泌体也可能能够递送功能性 AAV 衣壳，从而不仅提高体内功效，而且降低了免疫原性。由于其良好的安全性、稳定性和转基因表达的持续时间，AAV 通常用于基因治疗。AAV 载体的一个主要限制是 AAV 中和抗体 (nAb)，它存在于许多潜在患者中（阻碍治疗），并在初始给药剂量后在所有患者中发展（阻碍再次给药）。外泌体 (exoAAV) 中的封装是保护 AAV 免受抗体介导的中和的一种潜在策略，即使在 nAb 存在的情况下，也能实现有效的转导和重复给药。
外泌体作为一种治疗方式的好处和挑战
使用工程外泌体作为治疗递送载体的潜力是巨大的。如图 5 所示，其中一些好处包括：使用相同的基础平台以高浓度形式递送多种药物货物的能力，外泌体封装和保护其药物货物免受恶劣环境影响的能力，以及通过外泌体工程引入各种不同的药物样属性的能力。
图5. 使用工程外泌体的潜在好处。
虽然外泌体用途广泛，但有时需要在其中引入额外的药物样特性。下面讨论了其中一些障碍和潜在的缓解策略：
外泌体可以保护它们的货物免于血液中的降解，但由于快速吸收到组织和清除，它们在循环中的半衰期相对较短。虽然这种快速清除通常是一个优势，但如果需要较长的循环时间，可以通过将 CD47 等“不要吃我信号”工程化到外泌体表面来解决。还可以利用外泌体的局部递送来增加治疗药物对所选靶细胞的持续时间； 可以利用来自不同细胞来源的外泌体的自然向性来靶向特定器官。然而，来自常用临床级细胞系（如 HEK293）的 EV 可能无法归巢于所需的靶器官。为了解决这个问题，可以通过将靶向部分工程改造到囊泡上来改变外泌体的生物分布； 外泌体是天然存在的并且具有低免疫原性。为了进一步降低任何免疫原性风险，可以在可能的情况下使用人类蛋白质序列。一种蛋白质“冠”被证明围绕着血浆中的外泌体，这可能提供一种免疫原性屏障； 对于腔内装载的货物，治疗产品的细胞溶质递送可能需要改善内体逃逸或破坏。这可以通过外泌体的额外工程来克服，以包括融合剂或其它内体逃逸介质。 外泌体的生物发生是复杂的，细胞会产生囊泡亚群，这些囊泡的结合可能会有所不同。对囊泡生物发生理解的改进可能会推动优化的载药策略。亲和填料的使用也可用于将含有治疗性货物的外泌体与“空”囊泡和其它杂质分开。
然而，与任何令人兴奋的新模式一样，仍有挑战需要克服。其中许多与一般外泌体工作的技术考量有关，包括确定针对外泌体特定应用的最佳分离方法、细胞外囊泡制剂的异质性以及合适方法和设备的可用性。随着外泌体领域在过去几年中的扩展，在应对这些挑战方面取得了巨大进展。我们对分离方法如何影响外泌体制剂的特性有了更深入的了解，用于分析外泌体数量和内容物的定制设备也在不断改进，此外，对外泌体产生和异质性的生物学也有了更清晰的认识。
尽可能提高EV 作为治疗性产品的内在潜力可能还需要优化几个 EV 特性。根据临床应用和要递送的药物货物类型，这些可能包括延长 EV 的生物分布和药代动力学、最大化载药量、改善货物的细胞内递送以及避免吞噬细胞的非特异性摄取。
总结
工程外泌体表现出使其作为治疗药物的极具吸引力的关键特性，特别是它们能够靶向递送多种治疗性有效载荷的能力、良性安全性以及低免疫原性的潜力。随着外泌体领域的不断扩大，这项技术很可能会在更广泛的药物货物和疾病中得到其它应用。虽然在更广泛地使用外泌体疗法之前仍有许多障碍需要克服，但我们和其他团队正在解决这些剩余的挑战。通过这些努力，基于外泌体的疗法的真正潜力将在未来几年内实现。
原文：P.Jones, D.Carter, D.Lowe, et al., Engineered exosomes: a transformative therapeutic modality. Cell & Gene Therapy Insights 2022;8(4), 571–581.
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