伽马辐照层析柱使无生物负荷集成式连续生物生产成为可能
集成式连续生物生产的一个重要考虑因素是与生物反应器集成的下游层析步骤应在整个操作期间保持低生物负荷状态。实现这一目标的一种潜在策略是以无生物负荷状态开始并在功能上保持层析系统封闭。虽然层析系统本身可以无生物负荷，但将这些方法应用于层析柱时存在局限性。连续多柱层析中使用的更小的层析柱尺寸可以对可抛弃型层析柱进行伽马辐照，使其无生物负荷。然而，这种方法尚未广泛实施，可能是因为伽马辐照会对填料性能产生负面影响。这里，研究筛选并证实了多种保护性流动相改性剂有助于层析树脂保持接近“初始”的性能。然后将伽马辐照的层析柱集成到灌流生物反应器，以进行连续捕获。在开发和商业化环境中证明了使用Protein A、定制亲和填料和非亲和捕获填料在灌流生物反应器下游成功集成，并连续捕获超过 40 天，且可用于多种生物药模式。研究没有观察到基于时间的性能下降或生物负荷增长的迹象。该策略可实现无生物负荷的集成式连续生物生产操作，并可实现全工艺流程封闭并降低工厂的环境控制要求；因此，允许在宴会厅布置中同时进行多产品生产操作。
在当前产品管线多样化的环境中，越来越多的生物技术公司需要开发创新的解决方案，以实现高度灵活且具有成本效益的治疗性蛋白质药物生产。连续工艺技术提供了许多潜在的好处，例如改进的产品质量特性、更高的设备和填料利用率、更小的工厂占地面积、缩短的循环时间以及更低的投资和运营成本。
在过去的几年里，已经开发了许多技术来提高生物生产工艺的集成度。然而，一个剩余的争论领域是如何将无菌和封闭的生物反应器与传统上在受控/低生物负荷状态中进行的下游工艺联系起来。
随着灌流反应器运行时间长度的延长，初步捕获层析工艺中与生物负荷控制相关的风险会增加。通常，下游生物负荷控制策略包括与上游工艺的物理分离以及频繁的化学消毒。集成的连续生物工艺不太适合传统策略，因为在上游和下游操作之间长时间保持物理连接，有时频繁、快速的循环可能不允许化学消毒所需的长时间保持时间。因此，下游操作将不得不采用与生物反应器类似的方法，例如一次性或在线蒸汽灭菌 (SIP) 流路以及伽马辐照的管路和连接，以在工艺流程开始以及整个过程中保持无生物负荷状态.
下游层析操作依赖于三个关键部件：层析系统、工艺溶液和填充有合适介质/填料的层析柱。生产规模的层析系统已有商业化产品或可定制设计，从而可以无生物负荷状态开始并保持功能封闭状态。这可以通过使用具有 SIP 功能的不锈钢系统或最近可以采用辐照管路和接头的一次性层析系统来实现。同样，层析操作中使用的工艺溶液可以通过以下方式无生物负荷地输送到系统中，即使用无菌 0.2 μm过滤、预灭菌袋和无菌管路和接头。然而，通常用于下游步骤的层析柱不容易进行无生物负荷操作。
与需要单根大体积层析柱的批次层析工艺不同，连续多柱层析使用一系列多根较小的层析柱来提高工艺效率并更有效地利用层析填料。因此，连续层析法适用于使用预装的可抛弃型层析柱。通过使用预装的可抛弃型层析柱（或其它与辐照兼容的层析柱硬件），层析柱硬件可以通过伽马辐照变得无生物负荷。然而，层析介质/填料，尤其是基于蛋白质配基的层析介质/填料，对所提供的伽马辐照很敏感。众所周知，水溶液的伽马辐照会产生自由基和其它非自由基活性氧，它们会破坏蛋白质（例如，一些填料配基）和碳水化合物（例如，琼脂糖等填料基球）。抗氧化剂或自由基清除剂的存在已被证明对蛋白质和其它分子具有保护作用。我们假设在辐照期间向流动相中添加抗氧化剂等保护性成分有助于在伽马辐照期间保护层析填料。
在研究中，我们提出了一种通过伽马辐照使层析柱无生物负荷的方法，同时保持填料性能。初步研究结果显示，伽马辐照会影响亲和填料和非亲和填料的性能。
然后，研究对多种成分在辐照后保持填料性能的能力进行了筛选。填料在开发的修复缓冲液中进行辐照，之后进行功能测试，没有观察到对工艺性能的负面影响。开发的方法使灌流生物反应器与连续捕获的成功集成超过 40 天，没有基于时间的系统故障的迹象，也没有可检测到的生物负荷。此外，该策略已针对多个开发项目和规模进行了实施，并且已在商业化工艺中成功应用。开发的方法提供了一种简单的方法来实现无生物负荷的层析操作，同时保持与初始填料相同的性能，这反过来又有助于实现封闭、完全连续的生物工艺。
详细实验操作和结果分析，请参考原文。
实验评估了伽马辐照对多种层析填料的影响，包括Protein A 填料 MabSelect Sure 和 MabSelect Sure LX（Cytiva）、Amsphere JWT203（JSR）、KanCap A（Kaneka）；非亲和树脂 Capto Adhere (Cytiva)；以及使用骆驼源性抗体片段的定制亲和填料。
对于实验室规模的研究，层析填料装填在直径为 0.66 cm 的 Omnifit 柱（Diba Industries）中。对于大规模集成式连续捕获操作，使用 Ready to Process (Cytiva) 或 OPUS (Repligen Corporation) 预装的可抛弃型层析柱。使用的预装柱尺寸为 8 - 20 cm 内径。
层析柱冲洗和修复溶液用 25-50 mM、pH 6.5 的磷酸氢二钠七水合物和磷酸二氢钠一水合物（J.T. Baker）缓冲液。修复成分包括 0-200 mM L-组氨酸、L-蛋氨酸、甘露醇（J.T. Baker）和抗坏血酸钠（Spectrum Chemicals）。苯甲醇用作防腐剂（Spectrum Chemicals）。溶液在一个月内制备并用于缓冲液置换。
在 AKTA Explorer 或定制的 AKTA PCC 连续层析系统 (Cytiva) 上进行实验室规模层析运行。使用定制的SIP Bioprocess PCC 系统 (Cytiva) 进行大规模集成式捕获运行。
图1. 伽马辐照对层析填料的影响。(A) 伽马辐照前后Protein A 填料的结合载量。如方法部分所述，评估 IgG1 结合的静态结合载量。(B–C) 将初始和辐照过的 MabSelect SuRe (MSS) 填料与标记的抗体一起孵育，通过共聚焦显微镜成像，并通过光密度测定法进行分析。MSS 平均基球直径为 56 nm。填料基球外部 5 nm 被认为是边缘。初始填料基球边缘的光密度测量值已饱和。(D) 对用于从收获液中捕获酶的初始和辐照 Capto Adhere 填料进行循环，并测量每个循环的结合载量。报告的结合载量基于上样达到 2% 穿透的收获体积，并标准化为相应填料处理的第一个循环的结合载量。不同处理的循环 1结合载量没有观察到统计学上的显著差异。A-D 中的辐照填料在辐照前置换为 50mM 磷酸钠。
图 2. 筛选修复缓冲液对辐照后填料性能的影响。(A) 辐照前将MSS LX填料置换至不同的修复缓冲液，并测试辐照后的静态结合载量。修复缓冲液成分为甘露醇(M)、l -蛋氨酸(M’)、抗坏血酸钠(S)和l -组氨酸(H)。所有缓冲液含有50mm磷酸钠，对照组也是如此 (N/A)。暗条对应初始填料。(B) 测量MabSelect SuRe在不同水平的伽马辐照后的结合载量。修复成分与A组相同，标记为p的2%苯甲醇防腐剂(C) 随循环追踪Capto Adhere填料的酶结合载量。Adhere填料在缓冲液中单独辐照(正方形)或在SMM’h (三角形，与A-B组相同的SMM’h缓冲液)中辐照，并与初始填料(圆形) 进行比较。(D) 定制亲和填料在SMM 'H +P中辐照前后进行测试 (与图B中相同的缓冲液)。上样以体积为基础，产品总回收率在方型图中表示 (每种填料条件n = 20)。回收率归一化为n = 20 初始运行的平均。
图3. 采用MabSelect SuRe和Capto Adhere填料进行无生物负荷层析。(A) 使用2根MSS层析柱在连续多柱层析模式中捕获灌流抗体，在中试阶段没有共享上样，并在循环中跟踪结合载量 (每个柱归一化至第一个循环)。使用相同清洁条件的初始填料的生产商数据绘图以做参考。(B)在MSS洗脱液中测量的抗体产品质量属性。柱1和柱2的洗脱液合并在一起，每周取样并测量产品质量 (n = 7)。(C) 两个大规模测试的Capto Adhere结合载量。酶结合载量归一化至每次运行的初始循环。(D) Capto Adhere洗脱液中测量的酶产品质量。洗脱池检测PQA，并报告了运行A和B的结果。产品质量属性归一化为所有历史测试的平均值(n = 6)。红线表示适用时的下限接受标准。
总结
这项研究表明，可以对层析柱进行伽马辐照并保持填料性能。我们开发了修复缓冲液，通过在辐照期间向流动相中添加抗氧化剂等保护剂来帮助保持填料性能。修复缓冲液中使用的化学品简单、安全、便宜且易于获得。这种在辐照过程中保持填料性能的策略已在Protein A亲和填料（如 MabSelect Sure LX 和 MabSelect Sure）、一种具有骆驼源性抗体片段的定制亲和填料以及非亲和填料（如 Capto Adhere）中得到证实。测试的填料范围广泛，表明无论填料类型如何，都可以使用这种方法，并且可以在观察到性能问题之前主动应用。这种方法已应用于不同开发和商业化站点和规模的多个项目，并且是实现集成和连续捕获的关键组成部分，特别是当生物反应器和连续层析操作在延长的运行时间内直接集成时。此外，在整个工艺过程中应用伽马辐照层析柱的潜力有助于实现全过程封闭，更好地帮助实现多产品生产工厂，以及完全连续的端到端生物生产。因此，这项工作可以帮助生物生产行业实现在其它行业中观察到的连续工艺的全部优势。
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原文：C.Varner, R.Patil, R.Godawat, et al., Gamma irradiating chromatography columns enables bioburden-free integrated continuous biomanufacturing. Biotechnology Journal, 2020, DOI: 10.1002/biot.202000298.
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