mRNA：针对GMP生产的规模放大以及分析方法开发
鉴于 SARS CoV-2 mRNA 疫苗的巨大成功以及随之而来的对 mRNA 疫苗和治疗药物的极大兴趣，凸显了生产此类产品需要可放大的临床生产工艺，以及证明其安全性、效力和纯度的稳健分析方法的必要性。迄今为止，生产过程要么尚未公开，要么本质上是实验室规模的，并且不能轻易地适应临床和商业化规模的生产。为了满足这些需求，我们开发了一种基于水的可放大工艺，该工艺很容易适应符合GMP要求的生产，同时开发了产品表征、质量控制放行和稳定性测试所需的分析方法。我们还证明了在这种方法下，以生产规模生产的产品在相关动物模型中，mRNA产品编码疫苗免疫原和抗体，显示出良好的效力和保护作用。最后，文章将讨论原材料鉴定、采购和供应方面的持续挑战，以及mRNA 治疗药物和疫苗产品的冷链要求。虽然最终解决方案尚未阐明，但我们将讨论可以采取的、符合监管指南的方法。
针对GMP生产的规模放大和转移
由于在 mRNA 平台开发初期缺乏监管指南和既定期望，因此采用了源自疫苗监管环境的初始框架来进行技术转移以及工艺放大到GMP 生产。这种框架方法使团队能够通过高度保守的已知监管路径预先定义平台成功的验收标准，从一开始就为规模放大设计和质量控制奠定基础。
由于 mRNA 平台的新颖性，就规模放大设计和质量控制的保守方法达成共识在这个新的生产环境中被证明是无价的。与拥有庞大、可靠、目的性以及完善供应链的成熟疫苗生产平台不同，mRNA平台本质上需要新的材料，而后者通常只有研究级可用，缺乏既定的质量标志，例如常见于成熟的商业试剂的USP、EP 或 JP 级。
为了解决 mRNA 平台材料缺乏既定质量标准的问题，我们利用了预定义的验收标准，并对每种提议的材料进行了严格、深入的风险评估，以确定针对此类材料的控制措施。对患者安全、操作员安全、工厂交叉污染可能性、产品质量和监管障碍的影响是对每种新材料进行评估的几个类别。所有mRNA 平台材料供应商均经过质量部门的评估和认证。该过程涉及通过问卷调查和/或审计，获取与供应商的质量体系和运营相关的信息，因为它们与材料的生产和/或检测有关。其它控制措施，例如检测内毒素的来料放行检测、供应商的核酸酶检测以及在使用前对材料进行测序以验证材料，是风险评估中的几个例子。
对于I期生产，我们采用了 GMP 规模放大方法，该方法专注于一次性组件和成分，对小批量进行严格控制，并在可能的情况下采用封闭系统工艺。用于GMP 生产的 mRNA 生产工艺是基于来自合格供应商的一次性组件和部件库构建的，包括无菌验证文件包，同时针对许多关键组件，建立了备用合格供应商。
虽然我们以 I 期生产为目标，但使用这些一次性组件也是大规模生产的理想选择，因为它们固有地降低了微生物或 RNase 污染以及批次间核酸材料携带的风险。此外，使用一次性组件可以快速适应工艺开发的变化，并消除了GMP 生产中对清洁验证和确认的要求。
典型的 I 期生物工艺一次性生产组件的上游规模为 125 mL 至 200 L，下游工艺体积为 2 L 至 10 L。相比之下，上述 mRNA 平台的上游规模为300 mL 到 900 mL，通常产生的药物底物原液体积范围为 1 L 到 4 L。鉴于所用原材料的成本非常高，以及小规模条件下残留体积可能产生的负面影响，小体积操作可能非常具有挑战性。
为了解决这些问题，团队针对这个小规模的空间设计了新的组件和部件，并在可能的情况下，专注于对较小的处理量和封闭式工作操作进行严格控制。由于产品的性质，额外的重点是证明一次性组件和部件不含RNase。在平台设计和开发时，除了少数例外，大部分供应商没有能够证明组件和部件是无RNase 的。通过与主要供应商合作，我们建立了测试和认证的组件和部件库，这些组件和部件经认证不含RNase，因此可用于 mRNA 生产。
然后通过水运行测试新组件和部件的原型，首先逐项确定潜在问题并改进设计，然后与单元操作内部和跨单元操作的其它项结合在一起。水运行为mRNA 平台的设计和规模放大带来了多重好处，包括：(1)材料已成功测试并被认为可以制造；(2) 操作人员在生产运行之前就反复对工艺步骤进行实践培训；(3) 针对水运行创建了批文件，并在整个过程中用红线划线，以便为生产准备好最终草案。事实证明，这种方法可以在成本高昂的工程和GMP 运行之前大大降低整个过程、材料和操作的风险。
根据前文介绍的工艺开发，最终的 mRNA 生产过程分为 6 个主要单元操作：DNA线性化步骤、IVT 反应步骤、超滤/洗滤(UF/DF1) 步骤、层析步骤、第二次超滤/洗滤 (UFDF2) ，最后是药物底物原液过滤和灌装。开发的工艺基于300 mL IVT 反应平台，该平台可按 300 mL 增量进行放大。下表 II 和表III 中显示的结果表明，通过开发的工艺生产的产品在开发环境中执行时以及在符合GMP 的条件下转移到生产中时，都符合放行和稳定性测试的验收标准。
表2. mRNA 药物底物在 300 mL IVT 反应规模下的批间可比性
表3. 针对mRNA-LNP 非-GMP药物产品在加速温度条件下进行的稳定性评估
分析表征和放行分析方法开发
mRNA 疫苗和疗法的另一个挑战是缺乏一个整合且可转移的分析表征和放行检测包，以满足监管机构对良好表征产品的期望。开发和执行了mRNA和 mRNA-LNP 候选物的表征、批次放行和稳定性测试的分析方法，以监测关键质量属性、与工艺相关的残留物和安全性（表 2 和表 3），并且提议的规范基于监管要求以及与监管机构进行的IND 前讨论的反馈。与更成熟的治疗方式一样，检测分析包括对外观、pH和渗透压等质量属性的评估，以及用于测量内毒素、生物负荷和无菌性的安全性测试。评估mRNA 独有的关键属性包括 5' 帽和 poly-A 尾区域的表征，以确保分子在体内的适当稳定性和翻译，以及评估dsRNA 含量，以了解其激活先天免疫反应的潜力。此外，由于我们目前正在开发的mRNA 产品需要脂质制剂进行递送，因此需要测量脂质纯度和含量的分析方法，以支持mRNA-LNP 药物产品的批次放行和稳定性测试。
我们利用上述纯化方法在小规模研究IVT 反应中生产了许多 mRNA 编码疫苗抗原和单克隆抗体候选物。批次大小从用于动物模型研究的 5-10 mL 到已在 GMP 生产中进行的更大规模的300-900 mL 反应不等。无论 mRNA 是在开发过程中还是在 GMP 生产中合成和纯化，分析表征都显示出批次间的可比性（表2），从而证明了生产工艺的成功放大和技术转移。使用毛细管凝胶电泳 (CGE) 在变性条件下评估 mRNA 药物底物的纯度，其中在工艺开发和GMP 车间的生产中发现全长 mRNA 转录物的相对量 > 90%。通过CGE 分析判断，mRNA 药物底物中残留的杂质很可能是截短的 mRNA 物质。残留蛋白质杂质的清除通过专门用于检测 T7 聚合酶的酶联免疫吸附试验 (ELISA) 进行评估，因为该蛋白质是丰度最高的IVT 反应成分，而 qPCR 用于监测残留质粒 DNA 的去除。根据ELISA 和 qPCR 分析的判断，蛋白质和 DNA 工艺杂质均已成功清除至临床使用可接受的限度。
考虑到dsRNA杂质触发先天免疫反应的能力，mRNA 治疗药物也需要评估 dsRNA 含量。我们通过使用单克隆抗体试剂的ELISA 监测了 dsRNA 的存在，这些试剂专门用于检测长于 ∼30–40 bp 的 dsRNA。使用这种方法，dsRNA 含量已被证明占产品质量的不到0.5%。mRNA 的其它固有质量属性，如 5' 帽和poly-A尾，分别通过超高效液相层析 (UPLC) 和 CGE 方法进行评估。为评估加帽效率，如前所述，使用生物素化切割探针分离出一个含有5' 目的区域的小寡核苷酸片段，用于离子对反相UPLC 分析。包含含有假尿苷的 mRNA 对照样品，但在没有 5' 加帽试剂的情况下合成，有助于区分色谱图中加帽和未加帽的物质。使用这种方法，观察到的加帽效率> 95%，符合在 IVT 反应期间使用的 CleanCap 试剂制造商的预期值。目前正在开发的mRNA 转录本的 DNA 模板编码长度超过 100 个核苷酸的poly-A 尾，这是前面描述的关键质量属性。在用RNase A 酶消化以分离 poly-A 区域并随后通过 CGE 分析片段，poly-A区域的长度已被证实具有正确的大小，这有望赋予该分子足够的稳定性和体内翻译效率。
这些测试方法使平台方法能够进行分析开发，除了上述测试方法之外，mRNA编码的蛋白质的产品特异性评估通过基于细胞的表达测定进行评估。对来自转染细胞的表达蛋白质进行功能结合表征，以确认mRNA 分子的完整性并证明所表达蛋白质的关键表位在翻译时得到保留。ELISA方法被开发为表征的标准方法，尽管已使用其它配体结合平台，如Luminex 珠阵列和生物层干涉测量法 (BLI) 以及表面等离子体共振 (SPR)。
目前，mRNA 药物产品的制剂已与外包制造供应商合作进行。用于评估 mRNA-LNP 药物产品的分析方法（表 I）用于纯化的产品和过程中样品，视情况而定，以确保整个生产制剂过程中的产品质量。已在早期探索性临床前研究中使用的小规模制剂和大规模制剂之间证明了批次间的可比性。mRNA-LNP产品的CGE分析表明，从脂质制剂中释放的mRNA具有与mRNA原料药相当的纯度，主要药物产品峰的百分比通常超过85%–90%。mRNA-LNP 产品的粒径和多分散性通过动态光散射测量，显示在75 ± 25 nm 的尺寸范围内，多分散性指数低于目标标准0.1。封装效率通过基于荧光的 RiboGreen 测定法进行测量。比较 LNP 样品中游离mRNA 的浓度与被去污剂破坏的 LNP 样品中的浓度，发现封装材料的百分比始终 > 90%。外包制造商已对纳米颗粒内的 4 种脂质成分进行一致性和含量分析，并通过配备带电气溶胶 (CAD) 或蒸发光散射检测器 (ELSD) 的UPLC 进行分析。脂质含量比满足给定封装RNA 浓度的目标标准。与 mRNA 药物一样，mRNA-LNP 的效力通过来自转染细胞的表达蛋白的功能结合测定得到证实。迄今为止生产的mRNA 和 mRNA-LNP 候选物旨在于 ≤-65°C 下储存。目前正在进行长期稳定性研究，以及在 5°C、25°C 和-20°C 的加速温度条件下进行的评估。截至目前，已证明mRNA-LNP 在 25°C 下的稳定性长达 1 周（表 3）。如有必要，将对稀释的mRNA-LNP 药物产品进行额外的研究，以支持临床给药。
本文为以下文献内容简介，详细内容，请参考原文。
原文：J.Whitley, C.Zwolinski, C.Denis, Development of mRNA manufacturing for vaccines and therapeutics: mRNA platform requirements and development of a scalable production process to support early phase clinical trials. Transl Res, 2022.
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