mRNA 平台要求和可放大生产工艺的开发
鉴于 SARS CoV-2 mRNA 疫苗的巨大成功以及随之而来的对 mRNA 疫苗和治疗药物的极大兴趣，凸显了生产此类产品需要可放大的临床生产工艺，以及证明其安全性、效力和纯度的稳健分析方法的必要性。迄今为止，生产过程要么尚未公开，要么本质上是实验室规模的，并且不能轻易地适应临床和商业化规模的生产。为了满足这些需求，我们开发了一种基于水的可放大工艺，该工艺很容易适应符合GMP要求的生产，同时开发了产品表征、质量控制放行和稳定性测试所需的分析方法。我们还证明了在这种方法下，以生产规模生产的产品在相关动物模型中，mRNA产品编码疫苗免疫原和抗体，显示出良好的效力和保护作用。最后，文章将讨论原材料鉴定、采购和供应方面的持续挑战，以及mRNA 治疗药物和疫苗产品的冷链要求。虽然最终解决方案尚未阐明，但我们将讨论可以采取的、符合监管指南的方法。
在过去的十年中，基于 mRNA 的疫苗和疗法在增强蛋白质翻译、调节先天性和适应性免疫原性以及改善递送方面取得了重大改进，特别是在与脂质纳米颗粒(LNP) 技术相结合的情况下。在 SARS- CoV-2 大流行之前，在生产基于mRNA 的疫苗方面已经取得了重大进展，此类疫苗可在流感病毒、寨卡病毒、狂犬病病毒和HIV-1的动物模型中诱发针对传染病靶点的有效免疫。辉瑞/BioNTech的SARS-CoV-2 mRNA-LNP 疫苗和 Moderna 类似疫苗取得的进展，证实了mRNA-LNP 技术的潜力，并扩大了对稳健、一致且快速生产mRNA的需求，以扩大评估其它疫苗和治疗靶点。
RNA疫苗和治疗药物有两种主要方法。传统的非复制mRNA 编码目的基因并包括 5' 和 3' 非翻译区(UTR)，以增强基因表达，以及自扩增的 RNA，除了目的基因外，还编码特定的 RNA 病毒复制基因，以实现大量的细胞内 RNA 生产。这两种技术都利用宿主细胞机制来翻译 mRNA 编码的目标免疫原或治疗性蛋白质。这些 RNA 系统的一个重要组成部分是用于稳定、保护和定向 RNA以供细胞摄取和输送到胞质溶胶的递送机制。含有新型可电离阳离子脂质的 LNP 制剂是 RNA 递送领域的当前领导者，成功应用于小干扰RNA (siRNA) 以及编码疫苗抗原和治疗性蛋白的 mRNA。此处描述的工作利用由 Kariko 和Weissman 开发的非复制 mRNA 技术，结合了修饰的核苷、优化的 5' 和 3 UTR 序列、改进的密码子使用、确定的poly(A) 尾长和帽类似物。这种修饰的 mRNA 系统与 LNP 递送相结合，已证明诱导 T滤泡辅助细胞和生发中心形成，从而在临床前动物模型中产生强大和持续的免疫反应，进一步证明了开发该平台进行早期临床评估的必要性。
虽然 mRNA 生产可从合同制造组织（CMO）获得，但获得cGMP 材料的时间表以及生产和分析放行检测的成本对于小规模早期临床应用来说可能是令人望而却步的。此外，我们发现不仅需要研究团队以适合初始动物研究的规模进行mRNA 生产过程，而且还需要其可以从I期发展到商业化生产规模，且不改变产品质量属性特性。研究已经介绍了多种纯化体外转录mRNA 的方法，包括 LiCl 沉淀、市售的离心柱和离子对反相 HPLC，然而，这些方法不适合构建可规模放大且负担得起的工艺，并且可能不适合 cGMP 操作。此外，在小规模和生产规模上使用不同的原材料和工艺可能会产生产品质量属性的差异，不同规模之间生产工艺性能的差异必须在监管提交中解决，因其可能对临床开发构成风险。
为了满足广泛且可规模放大的 mRNA 生产的需求，我们开发了一个平台工艺，用于实验室规模的需求和 GMP 条件下的早期临床研究。此外，还开发了表征和放行检测方法，以实现早期 GMP mRNA 产品的生产和放行。这里，我们介绍一个简单、可放大且可重复的生产和纯化平台，为mRNA 提供临床试验使用所需的质量、纯度和安全性。使用商业化试剂优化了体外转录反应条件，以提供一致的mRNA 产量，而下游操作则侧重于使用可放大的过滤和层析系统去除工艺残留物和反应副产物，例如双链RNA (dsRNA)。研究建立了对支持开发和生产活动至关重要的分析测试方法，并对其进行了验证，以实现对工艺操作的快速评估，并放行可用于LNP 封装和灌装工作的 mRNA 药物底物。该平台产生的 mRNA 适用于LNP 封装，并且由此产生的 mRNA-LNP 已在多项动物研究中证明了蛋白质表达、强大的免疫反应和功效。
工艺开发
DHVI mRNA 药物底物生产平台的设计分为两个关键开发领域，上游酶法工艺和下游基于层析和超滤的纯化。所得纯化的裸mRNA 然后封装到脂质纳米颗粒 (LNP) 和最终制剂中。mRNA 构建体旨在结合许多有助于减少非特异性免疫激活和提高翻译效率的因素。为了减少先天免疫系统的激活，掺入了N1-甲基假尿苷修饰的核苷。为了提高可翻译性，质粒被设计为编码目标编码序列以及 5 和 3' 非翻译区(UTR) 和整个 101-碱基Poly(A) 尾，确保在人体细胞中翻译的最佳 poly(A) 尾长度。此外，还加入了来自TriLink Biotechnologies的CleanCap，以允许天然 I 型加帽结构的共转录结合。图1所示编码用于mRNA 表达的示例疫苗免疫原的质粒图谱显示了典型的抗原编码质粒图，该质粒图编码5'-UTR、编码序列、3'-UTR 和 poly(A) 尾。
图1.编码用于 mRNA 表达的示例疫苗免疫原的质粒图。
上游工艺涉及 3 个酶反应步骤：质粒线性化、mRNA 转录和DNA 模板消化。上游工艺的开发涉及可用原材料的选择和工艺参数的确定，以满足目标药物底物的质量属性和所需的产量。为了获得最佳的体外转录产量，从高质量模板DNA 开始至关重要。使用前需要的一些关键质量属性包括仅存在一条线性化DNA 条带、至少 70% 的超螺旋比例以及经测序验证的正确 poly(A) 尾长。迄今为止，DHVI（杜克大学人用疫苗研究所） 用于 IVT 反应的所有质粒均由商业供应商（Puresyn、GenScript以及Aldevron）生产，并可编码 1600 至2900 个碱基之间的转录物。对于质粒线性化，我们使用分子级注射用水（Intermountain Life Sciences）、NotI-HF 酶（New England Biolabs）和IVT 缓冲液（Promega）。研究设计并测试了使用 IVT 缓冲液进行基于NotI 的质粒线性化，以实现与后续转录反应的最佳兼容性。在线性化步骤之后，将线性化DNA 模板的等分试样添加到单独的反应容器中，然后添加IVT 缓冲液（Promega）、核苷酸三磷酸（ATP、GTP、CTP）（Promega）、T7 酶混合物(Promega)、假尿苷 (N1-甲基假尿苷-5'-三磷酸) (TriLink) 以及来自TriLink的 CleanCap 加帽试剂。RNA转录后，线性化 DNA 模板通过添加 DNase 酶和DNase 缓冲液添加物 (New England Biolabs) 进行消化。最后，加入 EDTA 以淬灭反应。供应商对每个合成步骤的原材料选择取决于满足所需 mRNA 药物底物质量属性的能力、支持工艺开发和早期 GMP 生产的可用性以及材料的等级。尽管选择了 GMP 级材料，但在可能的情况下，只要最终质量属性不受影响，在某些情况下也会使用非 GMP 研究级材料。我们发现内毒素控制是主要的原材料风险，因为它在原材料批次中存在差异，并且在随后的下游纯化步骤中难以去除。内毒素主要来自IVT 反应组分和纯化中使用的大体积缓冲液。研究仔细检查了每个反应步骤的反应搅拌、温度、孵育时间和反应物浓度，以获得可涵盖多种mRNA 构建体的稳健上游平台工艺。最终，所有步骤都在37°C 和 225 rpm 的摇瓶反应瓶（Corning）中孵育。我们发现不同的核苷酸或CleanCap 浓度对 IVT 产量有显著影响，而改变线性化 DNA 的量则没有。IVT 反应中的最终浓度为4mM CleanCap、5 mM 每种核苷酸（包括假尿苷）以及 0.05 mg/mL 线性化 DNA。质粒线性化、体外转录和DNase 消化各孵育 2 小时，而 EDTA 淬灭在37°C 下进行 15 分钟。这种优化的工艺可一致地产生 3–5 mg/mL 的全长 mRNA 药物底物以及低残留双链DNA。此外，它已在不同序列和长度的多个mRNA 构建体中得到证实。
下游平台工艺的从头设计需要选择填料以及适合纯化的缓冲液。该设计包括初始RNA 反应物稀释 (25X) 以及前后均进行切向流过滤（TFF 或超滤/洗滤 (UF/DF) ）的层析步骤。实施这些单元操作以去除酶反应物、残留DNA 和不需要的高分子量 (HMW) 物质。为了选择填料、过滤器和参数，我们开发了一种尺寸排阻层析 (SEC) 分析方法作为过程中工具，以评估整个下游开发过程中 mRNA 药物底物的纯度。阴离子交换、疏水和混合模式填料首先在结合-洗脱模式下进行了评估，证明这不足以获得所需的 mRNA 质量属性和纯化收率。然后评估多模式核基球填料并显示其提供足够的纯化性能，特别是去除酶反应物和残留DNA。开发的重点随后转移到选择 TFF 膜以及适当的操作体积和参数，以去除反应组分和杂质。这种下游平台工艺获得的每毫升IVT 反应大约 3 mg/mL 纯化的药物底物原液。相对于不可放大的氯化锂纯化工艺，cGMP 可放大的下游平台工艺获得了大约 80% 的纯化 mRNA 药物底物原液。已使用该平台纯化了多个序列，从1118 nt 到 2869nt，工艺收率从 72.7% 到94.8%不等。表 I 显示了GMP 生产规模的各种 RNA 构建体纯化工艺中的平均步骤收率和中间体浓度。
表1. 下游纯化的平均步骤收率和 mRNA 浓度
mRNA药物底物工艺和过程中检测总结在图2的流程图中。上游 mRNA 工艺包含 2个单元操作。第一个单元操作是 DNA 线性化，其中质粒 DNA 在单个容器中被NotI 消化，并在 37°C 下孵育。在执行线性化步骤之前，必须对线性化反应组分进行简短的预处理。无核酸酶水、5X IVT 缓冲液、超螺旋非线性质粒 DNA 和 NotI 限制性内切酶预处理需要预热所有材料。在质粒DNA 消化孵育期间，NotI 酶将特异性靶向并切割质粒 DNA。孵育完成后，对线性化的DNA 模板进行采样，并进入下一个单元操作。或者，线性化的DNA 可以冷冻保存或在室温下保存过夜。
图2. 可放大的 mRNA 生产工艺流程图和过程中检测。
上游工艺的第二个单元操作是 IVT 反应。这个单元操作是3个步骤的组合；mRNA IVT 反应 + 质粒 DNA 消化 + EDTA 淬灭。通过将水、5X IVT 缓冲液、NTP（ATP、CTP、GTP）、假尿苷、线性化 DNA 模板、CleanCap和 T7 酶混合物混合在一个容器中并在 37°C 下混合和/或孵育来转录mRNA。
在 RNA IVT 孵育结束时，将 DNase I 酶和10X DNase I 缓冲液添加到 RNA IVT 反应中，并在 37°C 下孵育以降解DNA 模板。在 DNase 孵育后，将 EDTA 添加到反应容器中以淬灭DNase 活性、稳定 mRNA 并减轻 mRNA 的沉淀。EDTA孵育完成后，对 mRNA IVT 进行采样，并进入下游单元操作。
下游工艺包含 4 个单元操作。下游操作从接收 IVT 反应产物开始，然后用无核酸酶水稀释。该操作的目的有 2个：从 IVT 反应物中稀释 EDTA 浓度，并防止和/或逆转 mRNA 沉淀。该材料进入UF/DF 步骤以浓缩和缓冲液置换稀释的 IVT。浓缩降低了总体积，以在层析单元操作中实现更快的工艺时间。缓冲液置换可纯化去除较小的IVT 反应组分，并使层析上样条件标准化。安装UF/DF过滤器，用无核酸酶水冲洗，并用缓冲液冲洗。然后将产物浓缩至目标体积，然后洗滤置换到缓冲液中。通过对UF/DF 组件进行顶洗来回收产品。
下游单元操作的第二步是多模式核基球层析步骤。在这个纯化步骤中，mRNA流穿填料，因为其孔径不允许配体与mRNA 相互作用。此步骤去除 IVT 反应组分污染物。对预装柱进行消毒、平衡、上样和漂洗；将流穿和漂洗液收集为单个馏分，并进行下一个单元操作。
mRNA 纯化工艺的第三步是UF/DF 步骤，以浓缩至目标浓度并将层析流穿和/或漂洗池洗滤到制剂缓冲液中。组装 UF/DF 过滤器，用缓冲液冲洗，然后用无核酸酶水冲洗。产物液流在被洗滤到无核酸酶的水中之前被浓缩。接下来，将产物缓冲液置换为最终制剂缓冲液（1.0 mM 柠檬酸盐，pH 6.4）。对 UF/DF 组件进行顶洗，以回收产物。
下游工艺的第四步也是最后一步是 0.2 µm 过滤，然后将封闭的药物底物原液灌装到无菌容器中。应该注意的是，任何不能被检测确认为无核酸酶的管路、层析或过滤部件需在环境条件下用0.5M NaOH 保持至少 1 小时，然后用无核酸酶水和适当的缓冲液冲洗以用于单元操作。
然后，由上述上、下游平台工艺生产的mRNA药物底物原液可以封装到LNP中。这些平台在不同mRNA 构建体之间具有可放大性和可转移性，使用上游、下游和LNP 封装工艺可获得一致的药物滴度以及LNP 封装的 mRNA 最终药物产品质量属性，无论是在中试还是 cGMP 生产规模，以足以供应早期临床试验。
本文为以下文献内容简介，详细内容，请参考原文。
原文：J.Whitley, C.Zwolinski, C.Denis, Development of mRNA manufacturing for vaccines and therapeutics: mRNA platform requirements and development of a scalable production process to support early phase clinical trials. Transl Res, 2022.
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