Science Advances ︱新颖！复旦季敏标课题组及其合作团队共同开发阿尔兹海默症淀粉样斑块的无标记SRS成像技术

Authorship (Chinese)︱LTNeurosci

Responding Editor︱LTNeurosci

Fig. 1 The theory, apparatus and application of SRS imaging.【1】

阿尔兹海默症（AD）的两个主要病理特征是β-淀粉样蛋白（Aβ）斑块的沉积和神经纤维缠结的形成。淀粉样蛋白级联假说认为，Aβ肽首先发生错误折叠，然后聚集成不溶性的斑块，进而导致神经元缺失，最终引发痴呆【2】。错误折叠的多肽通常富含β折叠构象（β sheet conformation），并且聚集形成寡聚物、原纤维及老年斑。越来越多的研究证明，这种蛋白聚集机制存在于一系列的神经退行性疾病中，包括AD、亨廷顿氏舞蹈病、帕金森病、朊病毒病（prion disease）等【2-3】。

然而，淀粉样蛋白假说一直存在争议，其原因在于我们对Aβ肽的命运、以它与其他疾病参数（例如tau蛋白的病理）之间的潜在关系都缺乏透彻性的理解【4-5】。因此，对蛋白质错折叠敏感的新型成像技术或许有助于加深我们对AD的认识，并期望能为蛋白质构象疾病的生物学和病理学研究提供新的线索。

现在，许多成像技术可以在不同条件下用于Aβ的检测【6】。例如，正电子发射层析成像技术（PET）可以在放射示踪剂的帮助下探测全脑范围内的Aβ含量；多种染色方法也可用于Aβ斑块的组织学研究。

Fig. 2 Typical Raman spectra of a cell and main biopolymers in cells.【7】

刚果红（Congo red）是一种常用于染色错误折叠蛋白的染料，因为它与β片状构象具有很强的亲和力【8】。刚果红也经常与偏振显微技术相结合来研究斑块的线性光学双折射【9】。目前，已开发了多种抗体并已应用到了AD中Aβ的免疫组化检测中【10】。此外，一些染料如硫黄素S（thioflavin S）和甲氧基XO4（methoxy XO4）等，也已用于双光子成像和纵向观察体内老年斑的聚集情况【11】。

近年来，尽管在诸如以上这些方面取得了丰硕的成果，但是，标记分子与蛋白质错误折叠和聚集之间存在的潜在干扰仍是一个值得关注的问题，而且这种干扰会增加实验设计和数据分析方面的复杂度【8, 11】。那么，无标签成像技术或许能够效避免由外源性分子所引起的问题，为AD显像提供新的手段。

到目前为止，振动分光光度法（vibrational spectroscopy）是检测蛋白质错误折叠的最具有前途的无标签技术【12】。红外光谱（Infrared spectroscopy ）和拉曼光谱（Raman spectroscopy ）能够通过酰胺波带（amide band）的光谱变化来揭示蛋白质构象的改变【12】。

诸多研究发现多肽主链中酰胺I（amide I）振动对蛋白质的二级结构的改变最为敏感【13】。红外光谱显示酰胺I波段在纤维形成时会发生红移（red shift）【12】，而拉曼光谱则会在相同振动模式下产生蓝移（blue shift）【14】。

由于受光学共振的影响，红外吸收可以在强列的信号强度下表现出其优势，但是红外吸收在生物组织中吸水过多，并且需要薄切片或使用氘水。而拉曼光谱与生物标本的兼容性更强，但是由于其微弱的信号强度，致使其成像速度缓慢，最终限制了它在生物医学成像中的直接应用 (Fig.1-3) 。

Fig. 3  Energy diagrams of the CARS and SRS processes.【7】

为了增强拉曼过程，研究者们已经开发了多种方法，如表面增强拉曼散射、尖端增强拉曼散射、共振拉曼散射、相干拉曼散射（CRS）光谱与显微技术等【15-18】。

其中，相干拉曼散射显微技术应用了非线性光学过程的相干性，且拉曼信号增强了几个数量级，因此能够在多种生物医学应用中进行快速、无标签化的化学成像【19-20】。相干拉曼散射显微技术主要有两种类型，即相干反斯托克斯拉曼散射（coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS)microscopy）显微技术和受激拉曼散射（stimulated Raman scattering (SRS) microscopy）显微技术，但一般认为SRS在保持拉曼光谱不失真方面更具有优越、更便于进行定量分析 (Fig.1-3) 【1,7,18, 21-22】。

2018年11月16日，来自（中国）复旦大学微纳米光子结构重点实验室、（美国）哈佛大学化学与化学生物学系、（美国）哈佛医学院麻省总医院MassGeneral神经退行性疾病研究所、（美国）Invenio成像公司的联合研究团队。将他们的一项新颖性研究成果以Label-free imaging of amyloid plaques in Alzheimer’s disease with stimulated Raman scattering microscopy为题发表在Science Advances（IF=11.511）上【23】。

在项研究中，Minbiao Ji（季敏标，文章第一作者兼第三通讯作者）等人应用SRS显微技术对AD模型（即APPswe : PS1dE9（APP : PS1）小鼠）脑组织中的淀粉样斑块进行成像研究(Fig.4A)。

Fig. 4  Schematics of the experimental design.

首先，研究揭示出SRS显微技术能够作为一种快速、无标记的显像模式；同时发现当原纤维和老年斑形成时，Aβ蛋白的酰胺I SRS光谱会发生蓝移，约10 cm⁻¹，进而可以从正常蛋白和脂质中识别出错误折叠的蛋白(Fig.4B-D)。

Fig. 5  Multicolor SRS images acquired on frozen AD mouse brain section.

Fig. 6  Comparison between SRS and antibody staining results on the same tissue section.

其次，通过冷冻薄片的抗体染色方法和新鲜组织的荧光成像技术，研究者们确定了彩色SRS可以在指纹区域内对新鲜脑组织、细胞、老年斑的组织性结构进行有效成像。简言之，Minbiao Ji 等人进一步肯定了SRS对Aβ斑块的成像能力(Fig.5-8)。

Fig. 7  Multicolor SRS images acquired on fresh AD mouse brain.

Fig. 8  Comparison between the SRS and thioflavin S–labeled two-photon imaging results on the same tissue. 

最后，研究者们还发现，相比而言，高频碳氢拉伸区（CH stretch region）的拉曼光谱对蛋白构象变化不敏感，因此不宜用于斑块的显像研究(Fig.9)。

Fig. 9  Two-color SRS images acquired on fresh AD mouse brain in the CH region.

总的来说，快速、无标记的彩色SRS成像技术可以作为研究AD病理学、以及其他有关蛋白错误折叠相关的神经退行性疾病的新手段。

补充阅读

第一作者兼第三通讯作者简介

季敏标 研究员

美国斯坦福大学博士

电话：[phone]

E-mail：[e-mail]

主要经历：
2005北京大学物理系学士

2011美国斯坦福大学物理系博士

2011-2014哈佛大学化学与生物化学博士后

2014-至今复旦大学物理系研究员

教学与研究领域: 非线性光谱学和非线性光学显微成像技术

1.利用超快光谱技术研究材料中载流子的非平衡态动力学以及手性分子的表征；

2.利用相干拉曼成像技术研究生物和生物医学问题，包括肿瘤的非标记探测和脂类代谢等问题；

3.利用非线性光学成像手段来表征材料和器件。

主要参考文献

【1】受激拉曼散射（SRS）显微成像技术在生物医学中的应用[A]. 季敏标. 第十八届全国光散射学术会议[C].2015

【2】D. Eisenberg, M. Jucker, The amyloid state of proteins in human diseases. Cell 148, 1188–1203 (2012).

【3】F. Chiti, C. M. Dobson, Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annu. Rev. Biochem. 75, 333–366 (2006).

【4】J. Hardy, D. J. Selkoe, The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease: Progress and problems on the road to therapeutics. Science 297, 353–356 (2002).

【5】E. Karran, M. Mercken, B. De Strooper, The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer’s disease: An appraisal for the development of therapeutics. Nat. Rev. Drug Discov. 10, 698–712 (2011).

【6】V. L. Villemagne, W. E. Klunk,et al., Aβ imaging: Feasible, pertinent, and vital to progress in Alzheimer’s disease. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging 39, 209–219 (2012).

【7】刘斌. 高分辨受激拉曼光谱显微成像及应用研究[D]. 哈尔滨: 哈尔滨工业大学.2016

【8】P. Frid, S. V. Anisimov, N. Popovic, Congo red and protein aggregation in neurodegenerative diseases. Brain Res. Rev. 53, 135–160 (2007).

【9】L.-W. Jin, K. A. Claborn, et al., Imaging linear birefringence and dichroism in cerebral amyloid pathologies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 15294–15298 (2003).

【10】H. Barelli, et al., Characterization of new polyclonal antibodies specific for 40 and 42 amino acid-long amyloid β peptides: Their use to examine the cell biology of presenilins and the immunohistochemistry of sporadic Alzheimer’s disease and cerebral amyloid angiopathy cases. Mol. Med. 3, 695–707 (1997).

【11】S. Liebscher, M. Meyer-Luehmann, A peephole into the brain: Neuropathological features of Alzheimer’s disease revealed by in vivo two-photon imaging. Front. Psychiatry 3, 26 (2012).

【12】M. Bouchard, J. Zurdo, et al., Formation of insulin amyloid fibrils followed by FTIR simultaneously with CD and electron microscopy. Protein Sci. 9, 1960–1967 (2000).

【13】R. Michael, A. Lenferink, G. F. J. M. Vrensen, E. Gelpi, R. I. Barraquer, C. Otto, Hyperspectral Raman imaging of neuritic plaques and neurofibrillary tangles in brain tissue from Alzheimer’s disease patients. Sci. Rep. 7, 15603 (2017).

【14】C. Ortiz, D. Zhang, et al., Analysis of insulin amyloid fibrils by Raman spectroscopy. Biophys. Chem. 128, 150–155 (2007).

【15】H. T. Beier, C. B. Cowan, et al., Application of surface-enhanced Raman spectroscopy for detection of beta amyloid using nanoshells. Plasmonics 2, 55–64 (2007).

【16】T. Deckert-Gaudig, E. Kämmer, V. Deckert, Tracking of nanoscale structural variations on a single amyloid fibril with tip-enhanced Raman scattering. J. Biophotonics 5, 215–219 (2012).

【17】M. Xu, V. Shashilov, I. K. Lednev, Probing the cross-β core structure of amyloid fibrils by hydrogen–deuterium exchange deep ultraviolet resonance Raman spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 129, 11002–11003 (2007).

【18】C. W. Freudiger, W. Min, et al., Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science 322, 1857–1861 (2008).

【19】B. G. Saar, C. W. Freudiger, et al., Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering. Science 330,1368–1370 (2010).

【20】M. Ji, D. A. Orringer, et al., Rapid, label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Sci. Transl. Med. 5, 201ra119 (2013).

【21】D. Fu, F.-K. Lu, et al., Quantitative chemical imaging with multiplex stimulated Raman scattering microscopy. J. Am. Chem. Soc. 134, 3623–3626 (2012).

【22】F.-K. Lu, S. Basu, et al., Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 11624–11629 (2015).

【23】Ji et al., Label-free imaging of amyloid plaques in Alzheimer’s disease with stimulated Raman scattering microscopy. Sci. Adv. 4 : eaat7715 (2018). 

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